曹龍奎，周志國，周慕潮，刁靜靜，馮興元，王學(xué)群，李麗娜，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江昊天玉米有限公司，黑龍江綏化 152000；3.大慶中禾糧食股份有限公司，黑龍江大慶 163319）

葉黃素是一種具有2個羥基末端和氧合類胡蘿卜素骨架C40結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素醇[1]，脂溶性類胡蘿卜素的一種，具有較強的抗氧化活性，對視力具有一定的保健作用[2]，還降低心血管疾病的發(fā)生率[3]，對乳腺癌、前列腺癌等癌細(xì)胞具有一定的抑制作用[4-6]，同時可以維持細(xì)胞正常功能、提高人體免疫力。葉黃素在人體內(nèi)無法直接合成，只能依靠外界攝取[7]，玉米淀粉生產(chǎn)副產(chǎn)物的玉米黃粉中含有大量的葉黃素，是一種優(yōu)良的葉黃素生產(chǎn)原料。超聲-微波協(xié)同提取是一種較為先進的提取方法，具有提取效率高、工藝簡單、能耗低等優(yōu)勢。因此，試驗采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取玉米黃粉中的葉黃素，擬得到玉米葉黃素的高效提取方法，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米黃粉，黑龍江昊天玉米開發(fā)有限公司提供；乙腈、甲醇等，為色譜純；乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M型臺式離心機，常州良友儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DZF-6050AB型真空干燥箱，上海坤天實驗室儀器產(chǎn)品；RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海貝倫儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；1290 2D-LC型高效液相色譜，Agilent公司產(chǎn)品；BILON-CW-1000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海比朗儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米黃粉葉黃素提取技術(shù)路線

精確稱量一定量過80目篩的玉米黃粉，按照一定的料液比添加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和表面活性劑，放入超聲-微波協(xié)同萃取儀中進行提取，得到葉黃素提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進行真空干燥，得玉米葉黃素粗品[8]。

1.3.2 單因素試驗方法

（1）表面活性劑種類對葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時間10 min，微波功率300 W，選擇十六烷基三甲基氯化銨（1631）、Tween-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉（SDS）等4種物質(zhì)作為表面活性劑，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，確定最佳的表面活性劑。

（2）表面活性劑添加量對葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時間10 min，微波功率300 W，分別考查表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，確定最佳的表面活性劑添加量。

（3）微波功率對葉黃素提取效率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取溫度35℃，提取時間10 min，微波功率分別為100，200，300，400，500 W，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與微波功率之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著微波功率變化的規(guī)律[9]。

（4）提取溫度對葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，微波功率300 W，提取時間10 min，提取溫度分別為25，30，35，40，45℃5個水平，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與提取溫度之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著提取溫度變化的規(guī)律[10]。

（5）提取時間對葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，按照料液比1∶15（g∶mL）加入95%乙醇，微波功率300 W，提取溫度35℃，提取時間分別為5，10，15，20，25 min，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與提取時間之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著提取時間變化的規(guī)律[11]。

（6）液料比對葉黃素提取率的影響。稱取玉米黃粉10 g，微波功率300 W，提取溫度35℃，提取時間10 min，料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，每個水平做3個平行樣，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取的工藝路線步驟試驗，按照葉黃素提取率技術(shù)方法計算提取率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出葉黃素提取率與液料比之間的關(guān)系曲線圖，分析葉黃素提取率隨著液料比變化的規(guī)律[12]。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法

采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取方法，試驗因素分別為葉黃素提取率（Y），微波功率（X1），提取溫度（X2），提取時間（X3），料液比（X4）。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.3.4 提取液中葉黃素類總含量的測定

（1）葉黃素HPLC色譜分析條件。流動相為乙醇∶甲醇∶乙腈=5∶5∶90，色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測波長450 nm，流速1.0 mL/min，進樣量1μL，柱溫30℃[13]。

（2）葉黃素提取率的計算方法。分別將葉黃素粗品用5mL乙酸乙酯進行溶解，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾后進行HPLC分析，測定樣品中葉黃素的含量，并計算葉黃素的提取率，計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對葉黃素提取率的影響

2.1.1 表面活性劑對玉米葉黃素提取率的影響

表面活性劑類型對葉黃素提取率的影響見圖1。

由圖1可知，不同的表面活性劑對葉黃素提取率的影響差異較大，但均高于對照組，說明表面活性劑的添加有助于玉米黃粉中葉黃素的提取[10]。通過試驗可以看出十二烷基硫酸鈉添加后提取率顯著高于其他組。因此，選擇十二烷基硫酸鈉作為試驗的輔助提取劑[14]。

2.1.2 表面活性劑添加量對玉米葉黃素提取率的影響

圖1 表面活性劑類型對葉黃素提取率的影響

表面活性劑添加量對葉黃素提取率的影響見圖2。

圖2 表面活性劑添加量對葉黃素提取率的影響

由圖2可知，隨著SDS添加量的不斷提高，葉黃素的提取率呈不斷上升的趨勢，在0.9%左右提取率接近最大值，之后趨于平衡。因此，選擇最佳的SDS添加量為0.9%。

2.1.3 提取時間對玉米葉黃素提取率的影響

提取時間對葉黃素提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對葉黃素提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時間的增加，提取率呈先增大后減小的趨勢，在15 min達到最大值。隨著微波時間的延長，葉黃素結(jié)構(gòu)也受到破壞，導(dǎo)致提取率不斷下降。綜合考慮，選擇提取時間15 min為中心進一步的試驗優(yōu)化[14]。

2.1.4 提取溫度對玉米葉黃素提取率的影響

提取溫度對葉黃素提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷增加，葉黃素提取率逐漸增大，當(dāng)提取溫度達到35℃時達到最大值。隨著提取溫度大于35℃后，對葉黃素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，葉黃素的提取率逐漸降低。因此為進一步明確提取溫度對葉黃素提取的影響，選取提取溫度35℃為中心進行進一步的試驗優(yōu)化。

圖4 提取溫度對葉黃素提取率的影響

2.1.5 微波功率對玉米葉黃素提取率的影響

微波功率對葉黃素提取率的影響見圖5。

圖5 微波功率對葉黃素提取率的影響

由圖5可知，隨著微波功率的不斷增大，葉黃素提取率逐漸增大，當(dāng)微波功率為300 W時達到最大值。當(dāng)微波功率大于300 W后溫度會隨之提高，對葉黃素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此為進一步明確微波功率對葉黃素提取的影響，選取300 W為中心進行微波提取的試驗優(yōu)化。

2.1.6 料液比對玉米葉黃素提取率的影響

料液比對葉黃素提取率的影響見圖6。

圖6 料液比對葉黃素提取率的影響

由圖6可知，隨料液比的增大，提取率先增大達到一定程度呈現(xiàn)平衡的趨勢。通過試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比在1∶15（g∶mL）后提取率趨于平衡，因此，為進一步明確料液比對葉黃素提取的影響，選取1∶15（g∶mL）為中心進行微波提取的試驗優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗的結(jié)果與分析

基于單因素試驗結(jié)果，以微波功率、提取溫度、提取時間、料液比為自變量X，以葉黃素提取率為固變量（Y），進行響應(yīng)面試驗[12]。

試驗安排及試驗結(jié)果見表2。

表2 試驗安排及試驗結(jié)果

回歸方程的方差分析見表3，二次回歸模型參數(shù)見表4。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可知，回歸模型p＜0.01，而失擬項的p＞0.05，說明該模型擬和結(jié)果較好。一次項、二次項p＜0.01，交互項p＜0.05，說明各項均不同程度影響葉黃素的提取率。

以葉黃素提取率為Y值，得出微波功率、提取溫度、提取時間、料液比為X值的回歸方程為：

表4 二次回歸模型參數(shù)

2.3 最優(yōu)條件確定

最優(yōu)提取條件及吸光度見表5。

表5 最優(yōu)提取條件及吸光度

提取效果最高時的微波功率345 W，提取溫度38℃，提取時間16 min，料液比1∶14.8（g∶mL），該條件下理論最大的得率為9.33%。驗證試驗得到葉黃素得率為9.30%±0.11%，與理論值非常接近，可以看出試驗建立的模型能夠較好地反映出超聲微波協(xié)同提取葉黃素的條件。

3 結(jié)論

通過對表面活性劑種類及添加量的單因素分析，確定最佳的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，添加量為0.9%。確定了超聲微波協(xié)同提取玉米葉黃素的最佳工藝參數(shù)為微波功率345 W，提取溫度38℃，提取時間16 min，料液比1∶14.8（g∶mL），該條件下得到葉黃素得率為9.30%±0.11%，研究得到了玉米葉黃素的高效提取方法，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。