許哲祥　姜碩　王宇晴　鄭春英

摘要 [目的]比較甘草內(nèi)生真菌GRE9與宿主植物甘草揮發(fā)性成分的相關性。[方法]利用氣相-質(zhì)譜法分析甘草內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液和菌絲體揮發(fā)性物質(zhì)。[結(jié)果]內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液及菌絲體既含有與宿主植物相同的揮發(fā)性成分，也含有特異性揮發(fā)性物質(zhì)。[結(jié)論]甘草內(nèi)生真菌GRE9是具有應用前景的內(nèi)生菌。

關鍵詞 內(nèi)生真菌;揮發(fā)性成分;GC-MS

中圖分類號 R284文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0198-03

Abstract [Objective]The research aimed to compare the correlation between the endophytic fungi GRE9 and? the volatile components of the host plant Glycyrrhiza uralensis.[Method]The volatile compounds of GRE9 strains fermented broth and its mycelium were analyzed by GCMS.[Result]The volatile components in the GRE9 fermented broth and its mycelium not only contained the same volatile components with the host crude drugs，but also contained the specific volatile substances. [Conclusion] GRE9 strain is a Glycyrrhiza uralensis endophytic fungus which has wild application prospect in future.

Key words Endophytic fungus;Volatile compounds;GCMS

研究表明，微生物在生長發(fā)育過程中能產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)[1]，這些揮發(fā)性物質(zhì)能夠刺激周圍植物的生長、促進其次生代謝產(chǎn)物的積累[2]，誘導植物產(chǎn)生抗病能力，同時也在生物防治、物種通訊中起著重要的作用[3]。研究植物內(nèi)生菌所產(chǎn)生的揮發(fā)性成分對于研究宿主植物與內(nèi)生菌之間的關系及內(nèi)生菌次生代謝物的動態(tài)積累具有重要的意義。

烏拉爾甘草（Glycrrhiza uralensis Fisch）為北方瀕危藥用植物[4]，具有抗病毒[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等多種活性作用，是臨床常用大宗中草藥之一。栽培種植雖然是解決甘草緊缺的替代方法[8]，但其采收期為2～3年，種植企業(yè)及農(nóng)戶資金回籠較慢。內(nèi)生菌由于參與宿主植物體內(nèi)成分的生物轉(zhuǎn)化、誘導藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[9]，因此作為研究目標，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)瀕危藥用植物的活性成分，減少藥用植物資源的使用。筆者以甘草內(nèi)生真菌GRE9為研究對象，對其揮發(fā)性成分進行分析檢測，考察甘草內(nèi)生真菌揮發(fā)性成分與甘草揮發(fā)性成分的相關性，為深入研究甘草內(nèi)生真菌揮發(fā)性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)

供試菌：內(nèi)生真菌GRE9，黑龍江大學生物制藥專業(yè)實驗分離得到。PDB培養(yǎng)基：同參考文獻[10]。

1.2 儀器與試劑

GC-MS聯(lián)用儀（7890AGC-240MS，美國安捷倫公司）。試劑均為分析純。

1.3 供試品溶液的制備

將GRE9活化，活化后接種于60 mL PDB培養(yǎng)基中（搖床培養(yǎng)條件：28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×10 7CFU/mL種子培養(yǎng)液。以5%（V/V）種子液轉(zhuǎn)接至300 mL PDB中按上述搖床培養(yǎng)條件培養(yǎng)14 d，抽濾，分別得到GRE9的發(fā)酵液及菌絲體。

1.3.1 內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液供試品的制備。

取“1.3”項下的發(fā)酵液，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液，50 ℃低溫濃縮至干，以10 mL乙酸乙酯溶解，制得發(fā)酵液供試品，備用。

1.3.2 內(nèi)生真菌GRE9菌絲體供試品的制備。

取“1.3”項下的菌絲體20 g，超聲破碎后，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），隨后同“1.3.1”，制得菌絲體供試品，備用。

1.3.3 對照藥材供試品溶液的制備。

稱取甘草生藥粉末10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超聲提取1 h，過濾，取濾液，將濾液于50 ℃條件下減壓濃縮至10 mL，得對照藥材供試品溶液，冷藏備用。

1.3.4 空白對照品的制備。

取滅菌后的PDB培養(yǎng)基600 mL，抽濾，50 ℃低溫濃縮至100 mL，乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），隨后同“1.3.1”，制得培養(yǎng)基空白對照品，冷藏備用。

1.4 GC-MS分析條件

1.4.1 GC條件。Rtx-5ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升溫程序：在60 ℃條件下保持6 min，隨后，以10 ℃/min 的速率升高至160 ℃，此溫度條件下保持5 min，再以20 ℃/min的速率升高至240 ℃，此溫度條件下保持10 min;進樣溫度為250 ℃;載氣（He）流速為1 mL/min;壓力設置為57.4 kPa;分流比（30∶1）;進樣量精確至1 μL。

1.4.2 MS條件。電子轟擊（EI）離子源;該條件下設置離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;溶劑延遲2.5 min;數(shù)據(jù)采集方式Scan;質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450;檢測器增益電壓1.18 kV。

1.5 試驗方法

采用GC-MS對GRE9菌株揮發(fā)性成分進行研究，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST Chemical Structures庫）檢索確定各樣品中的化學成分，并采用面積歸一化法確定各種化學成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS分析，GRE9菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性成分有13個峰，結(jié)果如圖1所示。GRE9發(fā)酵液揮發(fā)性成分通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，確定了13個峰，結(jié)果見表1。

2.2 內(nèi)生真菌GRE9菌絲體揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS分析，在GRE9菌株菌絲體的揮發(fā)性成分中發(fā)現(xiàn)并確定了7個峰，其結(jié)果如圖2，且這7個峰通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，分別得到了確認，其具體物質(zhì)名稱及相對含量見表2。

2.3 對照品藥材揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS分析甘草生藥供試品的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)并確定了12個峰，其結(jié)果如圖3，甘草生藥樣品揮發(fā)性成分通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，分別確認了12個峰的具體物質(zhì)名稱及其相對含量，結(jié)果如表3所示。

2.4 空白對照品中揮發(fā)性成分分析 通過GC-MS分析空白PDB培養(yǎng)基樣品的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)并確定了3個峰，其結(jié)果如圖4所示，這3個峰通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，分別確認其具體物質(zhì)名稱及其相對含量，結(jié)果見表4。

對比圖1～4，分析表1～4，發(fā)現(xiàn)有2種化合物（鄰苯二甲酸異丁酯和鄰苯二甲酸二丙戊酯）為4種供試品所共有，甘草內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液中有8種特有成分;菌絲體中含有5種特有成分;甘草生藥含有8種特有成分。對比甘草內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液與甘草生藥供試品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者相同的成分為十六烷酸和十八烷酸，而其余成分均具有差異性。

3 結(jié)論

甘草內(nèi)生菌GRE9發(fā)酵液中存在與宿主植物甘草相同的揮發(fā)性成分，表明甘草內(nèi)生菌GRE9與甘草可能具有相同的代謝機制;同時，甘草內(nèi)生真菌GRE9所含有的特異性揮發(fā)性成分，說明內(nèi)生真菌GRE9雖然分離自甘草莖部，但具有菌株生長特異性，更證實該菌具有一定的研究價值，為進一步研究和綜合利用GRE9菌株奠定基礎。

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