李 龍，蘇曉琴，方自安，周峻崗，胡小健，呂 紅

(1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438； 2.上海工業(yè)微生物工程技術研究中心，上海 200438)

菊粉(Inulin)是一種主要由β-D-呋喃果糖殘基通過β(2→1)鍵連接的多糖聚合物，其末端通常為葡萄糖.它存在于多種植物中，特別是在根或根莖中含量豐富，在植物根的干粉中菊粉的凈含量甚至超過70%[1].由于來源豐富，菊粉作為原材料被廣泛應用于高果糖漿的工業(yè)生產(chǎn)，它也可作為碳源生產(chǎn)乙醇等生物燃料以及作為動物飼料添加劑[2-4].

菊粉酶(Inulinase)又稱為2，1-β-D-果聚糖果糖水解酶，可以將菊粉水解成果糖和低聚果糖，它廣泛存在于酵母菌、曲霉和一些其他微生物中.菊粉酶可作為工業(yè)酶應用于食品工業(yè)中高果糖漿、低聚果糖和多聚果糖的生產(chǎn)[2，5-7]，也有一些報道將菊粉酶應用于乙醇的生產(chǎn)[8-10].酵母菌具有繁殖周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)以及生物安全性高等特點，從而成一種工業(yè)化生產(chǎn)菊粉酶的良好來源[11-12].其中，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)由于耐熱性好、產(chǎn)生的菊粉酶活力高和表達穩(wěn)定等特點而得到了廣泛的使用[12-14].

按照菊粉酶的反應類型，菊粉酶被分為外切菊粉酶(E.C.3.8.1.80)和內(nèi)切菊粉酶(E.C.3.2.1.7).其中外切菊粉酶水解菊粉末端的果糖單元，內(nèi)切菊粉酶則將菊粉斷裂為菊粉寡糖.前者能夠用于生產(chǎn)高果糖漿，后者用于生產(chǎn)不同聚合長度的菊粉寡糖[13，15].在1991年，Laloux等人克隆和表達了來源于K.marxianusATCC12424菌株的第一個外切菊粉酶基因INU1[16].為了深入研究馬克斯克魯維酵母外切菊粉酶INU1的結構和功能，我們在前期研究[15]的基礎上構建了馬克斯克魯維酵母INU1的表達質(zhì)粒，并在畢赤酵母中進行分泌表達，之后通過陰離子交換層析獲得了純化的INU1菊粉酶，成功結晶后我們解析得到了分辨率為2.8?的INU1晶體結構.對該晶體結構的解析和分析，將幫助我們確定催化反應的關鍵氨基酸以及為后續(xù)的酶學改造提供基礎.

1 材料與方法

1.1 表達載體的構建

以含INU1基因(GenBank: X68479.1)的原始質(zhì)粒CB104為模板，通過PCR擴增DNA并在基因的5’端和3’端分別引入SnaBⅠ和NotⅠ酶切位點，上游引物序列為5’-GACCTACGTAATGAAGTTCG-CATACTCCCTCTTGC-3’，下游引物序列為5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAACGTTAAATTGG-GTAACGTTAAAT-3’.PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖核酸電泳進行鑒定，然后通過DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)純化.純化后的PCR產(chǎn)物以及pPIC9畢赤酵母蛋白表達載體(Invitrogen公司)，兩者經(jīng)限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ(TaKaRa公司)雙酶切消化后進行連接反應，得到的重組質(zhì)粒pPIC9-INU1以核酸測序的方法驗證.

1.2 外切菊粉酶INU1的表達、活性檢測與純化

測序成功的重組質(zhì)粒pPIC9-INU1使用SalⅠ線性化后，通過電穿孔的方式(Eppendorf，電穿孔儀2510)轉化到畢赤酵母SMD1168(his4，pep4)菌株(Invitrogen，131020sa)中.通過平板篩選后挑取單菌落，于5mL YPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(200r/min、30℃)至OD600為2～6后，3000r/min、5min離心收集菌體.菌體重懸于50mL BMMOL/LY培養(yǎng)基，每24h加入終濃度為1%的無水甲醇誘導72h后，10000×g、15min收集培養(yǎng)上清液，收集的上清液在透析緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH 8.0)中透析4次，每次4h.

取0.5mL透析后的發(fā)酵上清液，與2.5mL 5%(質(zhì)量濃度)的菊粉混合，在0.05mol/L醋酸緩沖液pH4.7中50℃溫浴5min，反應后釋放的果糖或葡萄糖使用DNS比色法進行定量[17].酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位(U).

INU1可以使用陰離子交換柱進行純化，首先使用平衡緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH8.0)平衡HiTrap Q HP柱(GE公司)，然后將蛋白低速流過結合在Q柱上，最后用洗脫緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH8.0)和洗脫緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，pH8.0)梯度洗脫蛋白.以上各組分，以12%的SDS-PAGE膠鑒定蛋白表達和純化情況.

以截留分子量為30kDa的超濾管(Millipore公司)將純化后的蛋白洗脫液濃縮，并換液至20mmol/L Hepes pH7.2、200mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和5%甘油的緩沖液中進行結晶篩選.

1.3 結晶與數(shù)據(jù)收集和結構解析

在20℃培養(yǎng)條件下，使用Crystal Screen、Crystal Screen 2和PEG/Ion Screen晶體篩選試劑盒(Hampton research公司)進行結晶初篩，之后使用24孔板懸滴法對初篩得到的結晶條件進行重復和優(yōu)化.INU1菊粉酶的晶體衍射數(shù)據(jù)于中國科學院上海同步輻射中心(SSRF)BL17U線站收集[18]，衍射數(shù)據(jù)經(jīng)HKL2000[18]進行整合處理，之后使用分子置換方法進行結構解析，結構的解析優(yōu)化使用CCP4、Coot等軟件[19-20]，所有結構示意圖通過Pymol軟件(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schr?dinger, LLC)制作.INU1的結構數(shù)據(jù)已上傳到蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫(PDB序列號8J0T).

2 結果與分析

2.1 外切菊粉酶INU1的純化和結晶

通過畢赤酵母SMD1168(his4，pep4)分泌表達的INU1顯示出很高的酶活，在pH4.7的緩沖液中50℃條件下，INU1的酶活可以達到1671U/mL，比通過畢赤酵母GS115表達的外切菊粉酶活性要高得多[21-22].經(jīng)陰離子交換層析能獲得高純度的INU1蛋白，在SDS-PAGE膠上的蛋白條帶位置與INU1的理論分子量62kDa一致(圖1(a)，@@@484頁）.蛋白樣品濃縮至10mg/mL進行結晶篩選，初篩時在18%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸鈉pH 6.0、0.2mol/L MgCl2條件下獲得了INU1晶體.通過24孔板懸滴法進行重復優(yōu)化(1μL蛋白溶液和1μL沉淀劑溶液混合、1mL的池液)并在1周后獲得長條狀三維蛋白晶體，其尺寸為5mm×0.3mm×0.3mm(圖1(b)，@@@484頁）.晶體浸泡在防凍液(20%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸鈉、0.1mol/L MgCl2和20%甘油，pH6.0)約30s后，速凍于液氮中.

圖1 菊粉酶INU1的純化和結晶Fig.1 Thepurification and crystallization of inulinase INU1(a)為純化的SDS-PAGE膠圖.其中M條帶為蛋白分子量標準，S為畢赤酵母分泌表達的上清，P為表達后的沉淀，L為HiTrap Q HP的上樣樣品，F(xiàn)為未結合Q柱的流穿液.(b)為優(yōu)化后的INU1晶體.

2.2 外切菊粉酶INU1的整體結構

INU1晶體的衍射數(shù)據(jù)于中國科學院上海同步輻射光源(SSRF)BL17U線站收集，使用的X射線波長為1.0082?，曝光時間為1s，溫度為100K，晶體旋轉步長為0.5°，共收集旋轉100°的衍射圖譜數(shù)據(jù).

INU1晶體空間群為I4122，晶胞參數(shù)a=b=c=172.65?，Matthews系數(shù)為2.61?3/D，溶劑含量為52.82%.用于收集衍射數(shù)據(jù)的INU1晶體質(zhì)量較高，其鑲嵌度為0.62，分辨率達到了2.80?，收集的衍射數(shù)據(jù)有99.86%的完整性，Rmerge為9.8%(表1).

表1 INU1的晶體學參數(shù)表

*括號中為最高分辨率外殼層的值.

以氨基酸序列同一性為52%的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉化酶(PDB ID 4EQV)晶體結構作為模板，使用分子置換法我們完成了INU1的晶體結構解析.完成晶體結構優(yōu)化后的Rcrystal和Rfree值分別為0.20和0.27，平均B因子為50.12?2，拉氏圖(Ramachandran plot)分析顯示最后的結構模型中99.9%的氨基酸的二面角都處于最優(yōu)或允許的區(qū)間.

晶體結構顯示在每個不對稱單元中有兩個INU1蛋白分子面對面形成一個二聚體的堆積方式(圖2(b)).這兩條鏈的結構基本一致，把兩條鏈根據(jù)二級結構進行疊合時顯示Cα原子的均方根偏差為0.356?.計算兩個分子的表面積為34400?2，相互作用界面包埋的相互作用面積為6585.6?2，標準的解離自由能約為17kcal/mol，提示晶體中顯示的這個二聚體在溶液中也是一個非常穩(wěn)定的聚合狀態(tài)，這與GH32家族中其他糖苷水解酶的二聚化一致.在這個晶體結構中，還確定了20個結合的水分子，在每條鏈的Asn226還結合了兩個以β(1→4)糖苷鍵聯(lián)接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子(圖2(a)).

INU1共有555個氨基酸殘基，其中N端1～16號氨基酸為信號肽，17～23號氨基酸為前肽區(qū).在晶體結構中，除了N端前面的32個氨基酸和第252位到262位的一個環(huán)結構，其他氨基酸都能根據(jù)電子云密度清楚地確定位置.INU1的單體由兩個結構域組成: N端高度保守的β螺旋槳結構域，由5個典型的β折疊葉片(Ⅰ～Ⅴ)組成，而C端較不保守的β夾層結構域包括12個β折疊片層(圖2(c)).

INU1屬于糖苷水解酶32家族(Glycoside Hydrolase Family 32, GH32)(圖3).根據(jù)氨基酸序列相似性糖苷水解酶的可分為156個家族，GH32家族主要包括轉化酶(EC 3.2.1.26)、內(nèi)切菊粉酶(EC 3.2.1.7)、左旋糖苷酶(EC 3.2.1.65)和外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)等.該家族在結構上的主要特點就是具有保守的5葉片β螺旋結構域[23].INU1的晶體結構也與GH32家族成員基本一致，與其他GH32家族成員的二級結構疊合對比顯示Cα原子的均方根偏差范圍為1.35～1.55?(圖2(d)).

圖2 INU1的晶體結構Fig.2 The crystal structure of inulinase INU1(a)為INU1晶體的衍射圖；(b)非對稱單位中兩個INU1分子形成二聚體，分別為黃色和綠色顯示.圖中N-term和C-term標示了每條鏈的N端和C端.每條鏈的Asn226結合有兩個以β(1→4)糖苷鍵聯(lián)接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子，顯示為青色；(c)為單個INU1分子結構域；(d)為INU1與其他GH32家族蛋白結構的比對.圖中的PDB序列號3U75為西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)呋喃果糖苷酶，3KF5為S.occidentalis轉化酶，4EQV為S.cerevisiae轉化酶，1Y9M為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)外切菊粉酶，3SC7為無花果曲霉(Aspergillus ficuum)內(nèi)切菊粉酶.

圖3 INU1與呋喃果糖苷酶底物結合口袋的結構比對立體視圖Fig.3 The cross-eye stereo view of the substrate binding pocket in INU1 and fructofuranosidase from S. occidentalis圖中INU1顯示為黃色，西方許旺酵母來源的呋喃果糖苷酶(PDB序列號3U15)顯示為綠色，由6個果糖形成的菊粉分子顯示為青色.圖中還標示出了底物結合口袋周圍的重要氨基酸，氨基酸位置以INU1序列為參照.

3 討 論

我們嘗試在結晶條件中添加果糖和菊粉，但未能獲得INU1與底物的復合物結構.在西方許旺酵母來源的呋喃果糖苷酶中，有結合底物菊粉的復合物晶體結構[24].將INU1與該結構對比顯示，在底物結合口袋中與底物相互作用的氨基酸都是保守的(圖3，@@@486頁）.糖苷水解酶32家族的催化反應一般由Blade Ⅰ結構β1上的一個天冬氨酸或谷氨酸作為親核試劑，Blade Ⅲ結構β9上高度保守的Arg-Asp-Pro(RDP)基序起到穩(wěn)定催化過程中間態(tài)的作用，Blade Ⅳ結構β13上的谷氨酸作為質(zhì)子供體(圖4，@@@486頁）[25-27].根據(jù)序列和結構對比結果，外切菊粉酶INU1的Asp53、Asp182和Glu238應為主要的催化氨基酸，還有Asn52、Gln71、Trp79、Phe113、Ser114、Arg181、Asn273、Pro274和Trp335為與底物相互作用的氨基酸，其中Trp79、Phe113、Pro274和Trp335為提供疏水作用的氨基酸(圖3和圖4).

圖4 INU1與其他GH32家族蛋白氨基酸序列比對Fig.4 The amino acid sequence alignment of INU1 and others GH32 family proteins圖中黑色三角形為催化氨基酸，黑色圓圈為與底物有親水相互作用的氨基酸.

我們嘗試在結晶時加入菊粉作為底物，但在活性中心位置沒有找到明顯的底物或產(chǎn)物分子的電子云密度信號.另外可能由于構象不固定，在INU1結構靠近糖基化基團Asn226附近的第252到262位的一段環(huán)狀結構沒有清晰的電子云密度.在這一區(qū)域附近，還有一些難以辨認的電子云密度信號，它們可能是較長的糖鏈分子，也可能是非特異結合的菊粉分子.