任雅君，王海翔，王歲樓*，徐艷艷，田吉來

(1.中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.麗水市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)室，浙江 麗水 323000； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

替加環(huán)素(Tigecycline)為甘氨酰環(huán)素類抗菌藥，半合成四環(huán)素米諾環(huán)素的衍生物。為第一個批準上市的甘氨環(huán)素類抗菌藥物。該藥克服了四環(huán)素的兩種主要耐藥機制：藥物特異性外排泵和核糖體保護。替加環(huán)素對許多革蘭陽性和陰性細菌有效，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌以及產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。其通過與核糖體30S亞單位結(jié)合、阻止氨?；痶RNA分子進入核糖體A位而抑制細菌蛋白質(zhì)合成。因其不受β內(nèi)酰胺酶、靶位修飾和酶靶位改變等耐藥機制的影響，具有廣譜抗菌活性[1]。但由于替加環(huán)素組織分布廣、蛋白結(jié)合率高、腦脊液濃度低、臨床常規(guī)治療多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)顱內(nèi)感染療效差的問題，其臨床療效受到限制[2]。

超聲聯(lián)合微泡技術(shù)(ultrasound combining microbubbles，USCM)被證實可以有效、安全和可逆地打開血腦屏障，是一種理想的實現(xiàn)藥物靶向性、無創(chuàng)地進入顱內(nèi)組織的技術(shù)方法[3-4]。其原理是將超聲微泡造影劑(ultrasound contrast agents,UCA)作為載體，將藥物包載于微泡中，后通過超聲輻照定點靶向釋放藥物達到治療的目的[5-6]。具體來說，即靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波的作用下會不斷地產(chǎn)生非對稱性收縮和膨脹，當(dāng)聲能達到一定強度時，微泡就會破裂，這樣藥物就被釋放到超聲所輻照的局部組織中，從而發(fā)揮定位靶向治療作用。目前，測定替加環(huán)素含量多用反相液相色譜法：Li等[7-8]等均采用C18柱、磷酸緩沖液-乙腈(72∶25)作為流動相測定替加環(huán)素含量，出峰時間8 min左右，均獲得良好的線性及回收率；吉同琴等[9-10]采用C18柱、乙酸銨溶液(含EDTA和四氫呋喃以及三乙胺調(diào)pH 7.9)為流動相，出峰時間15 min左右，線性與回收率良好。

本試驗制備了不同藥脂比的載替加環(huán)素脂質(zhì)微泡，通過查閱大量文獻，優(yōu)化建立新型高效液相色譜(HPLC)法測定其包封率，以篩選出最佳藥脂比，同時證實了微泡與藥物聯(lián)用的可行性，為后期超聲輻照靶向釋放藥物試驗奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LCsolution 15C型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AX224型分析天平(日本島津公司)；FD-1C-50型真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；YJ-100型銀汞膠囊調(diào)合器(杭州新亞光電儀器有限公司)；恒溫磁力攪拌器(美國Scilogex公司)；TGL-16G型冷凍超速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；pH測定儀(上海雷磁儀器廠)。

1.2 試藥 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC，蘇州東南藥業(yè)股份有限公司)；1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油鈉(DPPG-Na，蘇州東南藥業(yè)股份有限公司)；生物素化磷脂(DSPE-PEG2000-Biotin，Aladdin公司)；替加環(huán)素標準品(99%，批號：291641，北京百靈威科技有限公司)；SF6(99.999%，南京上元工業(yè)氣體廠)；pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS，自制)；甘油、叔丁醇、草酸、磷酸二氫鈉、EDTA-2Na、三乙胺均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 載藥微泡的制備

2.1.1 空白脂質(zhì)微泡的制備 稱取一定量DSPC、DPPG-Na、DSPE-PEG2000-Biotin溶于20 mL叔丁醇，再加入適量PEG4000和少量棕櫚酸，60 ℃水浴溶解60 min；冷凍干燥30 h；取凍干粉一瓶加入1 mL PBS/甘油水合液45 ℃水化30 min，4 ℃靜置20 min，再水化30 min，室溫放置。磷脂濃度為4 mg·mL-1。充入SF6氣體，銀汞膠囊調(diào)和器振蕩90 s。空白脂質(zhì)體制備完成，靜置分層，上層乳白色泡沫狀，下層清液。4 ℃保存。

2.1.2 載替加環(huán)素脂質(zhì)微泡的制備 成膜材料及輔料同空白微泡，再分別精密稱取4、2和1 mg的替加環(huán)素，用適量叔丁醇溶解后，緩慢加入磷脂溶液中，60 ℃水浴攪拌1 h。其余步驟同“2.1.1”項下。即制得藥脂比分別為10∶1的T1組、20∶1的T2組和40∶1的T3組三組載藥微泡。載藥微泡靜置分層，上層呈黃綠色泡沫狀，下層清液。4 ℃保存。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜柱 Welch XB-C18柱(4.6 mm× 150 mm，3 μm);流速:1 mL·min-1;柱溫:25 ℃;進樣體積:20 μL。

2.2.2 流動相 磷酸鹽緩沖液[(0.015 mol·L-1的磷酸二氫鈉溶液和0.015 mol·L-1的草酸以及0.002 mol·L-1的EDTA-2Na(三乙胺調(diào)pH 7.0)]-乙腈溶液(75∶25)。使用前過0.45 μm有機濾膜。

2.2.3 檢測波長 在190～400 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，得到替加環(huán)素的兩個較大吸收峰出現(xiàn)在248.1 nm和357.7 nm處，因在248 nm處的吸收更靈敏，響應(yīng)值更大，故選擇248 nm作為最大吸收波長。

2.3 標準品溶液配置 精密稱取替加環(huán)素標準品5 mg超聲溶解于25 mL流動相中，制成0.2 mg·mL-1標準品儲備液。4 ℃保存。使用前過0.45 μm有機濾膜。取20 μL進樣測定，觀察保留時間、峰形與拖尾因子，結(jié)果如圖1。

圖1 替加環(huán)素標準溶液0.2 mg·mL-1色譜圖

3 方法學(xué)驗證

3.1 標準曲線繪制 取儲備液按照一定比例稀釋，配制成5、10、20、40、80、100、200 μg·mL-1一系列濃度標準品溶液，HPLC進樣測定，外標法定量。 以峰面積(UV)為縱坐標，濃度(μg·mL-1)為橫坐標做線性回歸。由結(jié)果可知，替加環(huán)素標準品200 μg·mL-1的色譜峰峰形良好，保留時間為7.728，理論塔板數(shù)為8 663.2，拖尾因子為1.2，無其他雜質(zhì)峰。

標準曲線的線性回歸方程為Y=44 468X-121 566,R2=0.999 5。說明替加環(huán)素在5～200 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好。

3.2 重復(fù)性測試 配6份40 μg·mL-1替加環(huán)素標準品溶液，分別進樣測定。計算RSD值，結(jié)果如表1。由結(jié)果可知，6份相同濃度的標準品進樣結(jié)果的RSD=2.2%，說明該法重復(fù)度較好。

表1 RP-HPLC法測定替加環(huán)素含量的重復(fù)度試驗

3.3 精密度測定 取40 μg·mL-1標準品溶液連續(xù)測定6次，計算RSD(%)，結(jié)果如表2。由結(jié)果可知，連續(xù)6次進樣結(jié)果的RSD為2.1%，說明該方法精密度較好。

表2 RP-HPLC法測定替加環(huán)素含量的精密度試驗

3.4 加標回收率測定 取9份0.2 mL空白脂質(zhì)微泡溶液，分別加入0.08、0.1、0.12 mg替加環(huán)素標準品。流動相定容至1 mL，配置成80、100、120 μg·mL-13種濃度加標待測液，每種3個平行，HPLC測定峰面積，計算濃度、回收率及RSD(%)，結(jié)果如表3。

由試驗結(jié)果可以看出，高、中、低3個濃度水平組的加標回收率分別為104.3%(RSD=0.8%)、100.3%(RSD=1.5%)、99.6(RSD=0.4%)。說明在本試驗條件下替加環(huán)素的回收率良好，輔料(空白脂質(zhì)微泡)對主藥(替加環(huán)素)的測定無影響。該方法測定替加環(huán)素的含量可行。

表3 加標回收率試驗結(jié)果

3.5 包封率測定 采用高速離心沉淀法：混勻包裹的新鮮載藥微泡溶液樣品 1 mL，12 000 rpm離心 10 min后取下清液，過0.45 μm濾膜后進樣，測定游離的替加環(huán)素含量。每種樣品測定3次。

包封率(%)=(投入的替加環(huán)素總量-游離的量)/投入的替加環(huán)素總量×100%

載藥量(%)=(投入的替加環(huán)素總量-游離的量)/磷脂用量×100%

由表4及圖2所示，T1組、T2組和T3組的包封率分別為54.3%±4.9%、86.8%±0.6%和71.3%±1.6%；載藥量分別為5.4%±0.5%、4.3%±0和1.8%±0。三者的包封率都較為理想，T2組即藥脂比為20∶1的載藥微泡的包封率最大，T1組即藥脂比為10∶1的載藥微泡的包封率最小。因此，最終選擇藥脂比為20∶1作為載藥微泡的制備條件。

表4 3組載藥微泡包封率與載藥量測定結(jié)果

4 討論

4.1 流動相的選擇 替加環(huán)素是四環(huán)素的結(jié)構(gòu)類似物，擁有該類化合物相似的化學(xué)特性。同時為含氮堿性藥物，極性較大，可以與金屬離子形成金屬螯合物，并吸附在反相色譜柱中的硅烷醇基上而難以洗脫，從而導(dǎo)致色譜峰拖尾[11]。此外，硅膠中的微量金屬可以導(dǎo)致硅羥基的酸性增強，也會導(dǎo)致主峰拖尾[12]。

為了消除金屬離子的影響，提高流動相的洗脫性，本試驗考察了磷酸、草酸、三乙胺以及EDTA-2Na的加入對色譜峰值的影響，包括拖尾因子、保留時間以及理論塔板數(shù)。試驗證明，草酸的效果較磷酸更好，三乙胺和少量EDTA-2Na的加入能夠改善峰形、提高峰形的對稱性、降低拖尾因子。因此最終選擇了磷酸緩沖液(加入適量草酸與EDTA-2Na，并用三乙胺調(diào)節(jié)pH至7.0)-乙腈(75∶25)為流動相，此時的替加環(huán)素色譜峰峰形理想，定量準確。

A.空白樣品色譜圖；B.T1組色譜圖；C.T2組色譜圖；D.T3組色譜圖圖2 不同樣品色譜圖

4.2 溶劑的選擇 由于替加環(huán)素在水中溶解度較好，試驗考察了以水作溶劑和以流動相作溶劑的替加環(huán)素色譜峰，發(fā)現(xiàn)流動相作溶劑的色譜峰拖尾因子更小，理論塔板數(shù)更大，峰形更理想。原因可能是流動相具有更接近中性的pH，而替加環(huán)素在中性溶液中穩(wěn)定性更好。因此采用現(xiàn)配現(xiàn)用的流動相作為溶劑和稀釋劑。

4.3 包封率測定方法的選擇 測定載藥微泡包封率的方法有很多種，如超速離心法、凝膠層析法、超濾膜過濾法、微型柱離心法和透析法等[13]。凝膠層析法、超濾膜過濾法、微型柱離心法均較煩瑣、耗時長、原材料較貴，對脂膜或藥物有一定吸附，導(dǎo)致檢測誤差增大，而且大小為微米級的微泡經(jīng)分離柱洗脫時很難保證順利通過以及不被破壞，而透析法會因多次換液透析后，測算相對困難，因此，本試驗選擇了超速離心法作為載替加環(huán)素微泡包封率的檢測方法，此方法快速準確、操作簡便。通過離心將未包封進微泡的藥物濾出，測定其中藥物含量，再由投藥總量計算包封在微泡內(nèi)的藥物含量。此為間接計算包封率的方法，結(jié)果顯示本試驗制備工藝下脂質(zhì)微泡有較為理性的包封率。