帖余，李麗，劉軍*，附俊杰，王景峰，王國(guó)強(qiáng)，趙琦鍇

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000)2(樂(lè)山恒峰華邦生物科技有限公司，四川 樂(lè)山，614000)

菜粕是菜籽榨油后的副產(chǎn)物，其中粗蛋白含量為35%～40%，與豆粕蛋白相比蛋氨酸和胱氨酸含量更高，且含有豐富的金屬元素，如鐵、錳、銅、鈣、磷、硒等，是一種價(jià)廉易得的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[1]。但菜粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如硫苷、植酸、芥酸和單寧酸等[2]，限制了其在食品、飼料行業(yè)中的應(yīng)用。其中硫苷為主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，分解后會(huì)生成惡唑烷硫酮、異硫氰酸酯、腈等有毒物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)動(dòng)物甲狀腺、肝、腎都會(huì)產(chǎn)生毒害作用[3]。植酸主要能與蛋白質(zhì)、銅、鋅、鈣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合形成難以消化的絡(luò)合物[4]，降低菜粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另一方面，由于菜粕蛋白中小肽含量低，相比于豆粕、魚(yú)粉蛋白更難被消化[5]。因此，降低菜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子硫苷、植酸含量并提高小肽含量，對(duì)提高菜粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，解決蛋白質(zhì)原料供應(yīng)緊缺的問(wèn)題具有重要意義。

為了改善菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)菜粕的脫毒方法進(jìn)行了大量研究，包括物理脫毒法、化學(xué)脫毒法、微生物發(fā)酵法和遺傳育種法。微生物固態(tài)發(fā)酵法經(jīng)濟(jì)高效、重現(xiàn)性好[6]，近年來(lái)常被用于菜粕脫毒、提取菜籽抗氧化肽等[7-8]。CROAT等[9]利用正己烷預(yù)處理菜粕后，通過(guò)里氏木霉30 ℃發(fā)酵168 h后將菜粕中硫苷降至0.4 μmol/g。但存在有機(jī)試劑殘留，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。MAHAJAN等[10]通過(guò)添加純酶制劑降解植酸、硫苷，其降解率分別達(dá)到71%、60%。但通過(guò)添加純酶制劑處理菜粕降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，一方面降低了酶和底物的耦合度使得酶解效率低下，另一方面也增加了處理成本。

目前大部分研究側(cè)重于通過(guò)微生物一步發(fā)酵法降解抗?fàn)I養(yǎng)因子[11-13]，但未考察過(guò)通過(guò)發(fā)酵后結(jié)合酶解的方式進(jìn)一步降解菜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于黑曲霉具有產(chǎn)酶系較全且安全性高的特點(diǎn)[14]，并符合農(nóng)業(yè)部頒布的安全發(fā)酵菌株要求，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇一株能降解硫苷、植酸的黑曲霉發(fā)酵菜粕，發(fā)酵結(jié)束后利用黑曲霉在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種酶進(jìn)一步酶解發(fā)酵后的菜粕，通過(guò)發(fā)酵、酶解兩步法降低菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子硫苷和植酸含量，提高菜粕中小肽含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉,購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 原料

菜籽粕(水分含量10.57%)、麩皮(水分含量9.31%),樂(lè)山恒峰華邦科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基：察氏瓊脂培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(蔗糖3%；NaNO30.3%；K2HPO40.1%；MgSO4·7H2O 0.05%；KCl 0.05%；FeSO40.001%；瓊脂1.5%～2%；121 ℃滅菌20 min)。

黑曲霉麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮∶水=2∶1 (g∶mL)，自然pH；混勻取 30 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕(絕干)∶麩皮(絕干)∶水=7∶3∶15 (g∶g∶mL)，自然pH；混勻取 60 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器設(shè)備

T-114型分析天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司；QYC-2102C型恒溫培養(yǎng)搖床,上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MF 80BSH-2型霉菌培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LS-75HD立式高壓蒸汽滅菌器,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 型超級(jí)潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀,山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子制備

勾取5～7環(huán)保藏的黑曲霉接種于種子培養(yǎng)基中，混勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將黑曲霉麩皮種子以5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)；發(fā)酵一定時(shí)間后取30 g發(fā)酵菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩網(wǎng)測(cè)定指標(biāo)。

1.3.3 酶解

取固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后的30 g發(fā)酵菜粕裝入自封袋，45 ℃密閉恒溫酶解24 h；之后將菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)40目篩網(wǎng)測(cè)定指標(biāo)。

1.3.4 發(fā)酵、酶解時(shí)間對(duì)硫苷、植酸含量的影響

固態(tài)發(fā)酵時(shí)間：分別考察發(fā)酵一定時(shí)間(12、24、36、48、60、72 h)和發(fā)酵相應(yīng)時(shí)間并酶解24 h后硫苷、植酸含量的變化情況。

酶解時(shí)間：考察經(jīng)一定時(shí)間發(fā)酵并經(jīng)過(guò)不同時(shí)間(0、6、12、18、24、30、36 h)酶解后硫苷、植酸含量的變化情況。

1.3.5 底物組成、表面活性劑、初始發(fā)酵水分對(duì)硫苷、小肽含量及產(chǎn)酶的影響

底物組成：考察發(fā)酵底物中麩皮與菜粕的比例(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6)對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

表面活性劑：考察含水混合發(fā)酵底物中不同吐溫80添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

初始發(fā)酵水分：考察不同初始發(fā)酵水分(51%、55%、59%、63%、67%、71%)對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)酶及酶解后硫苷、小肽含量的影響。

1.3.6 理化指標(biāo)測(cè)定

硫苷按照氯化鈀法[15]測(cè)定。

植酸按照文獻(xiàn)[16-17]測(cè)定。

小肽按照文獻(xiàn)[18]測(cè)定；蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照凱氏定氮法。

酸性蛋白酶活按照文獻(xiàn)[19]測(cè)定。

CMC酶活按照文獻(xiàn)[20]測(cè)定。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性多重比較，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以P<0.05作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫苷、植酸含量變化的影響

如表1所示，經(jīng)過(guò)酶解后，硫苷，植酸含量相比于單步固態(tài)發(fā)酵明顯降低，且發(fā)酵時(shí)間對(duì)降解硫苷、植酸的影響十分明顯。發(fā)酵前36 h，硫苷、植酸含量基本不變，發(fā)酵至48 h時(shí)硫苷含量降至最低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)48 h，植酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而下降，但硫苷含量隨發(fā)酵時(shí)間增加。將經(jīng)過(guò)各時(shí)間發(fā)酵后的菜粕進(jìn)一步酶解，相比于單步發(fā)酵，除發(fā)酵12 h外，硫苷、植酸含量均明顯降低。發(fā)酵48 h后繼續(xù)酶解24 h，硫苷含量降至最低，相比于固態(tài)發(fā)酵降低了30.51%，植酸含量降解至1 mg/g以下。

表1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)降解硫苷、植酸含量的影響Table 1 Effect of fermentation time on degrading glucosinolates and phytic acid

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

發(fā)酵前36 h，黑曲霉產(chǎn)生降解硫苷、植酸的酶量少，經(jīng)酶解后只有少量硫苷、植酸被降解；發(fā)酵至36～48 h，黑曲霉大量分泌降解硫苷、植酸的酶，經(jīng)酶解后硫苷、植酸均降至最低水平；發(fā)酵60～70 h后酶解，硫苷含量相比于發(fā)酵48 h后酶解顯著增加(P<0.05)。到發(fā)酵后期，碳水化合物被大量消耗，蛋白質(zhì)成分富集[21]，也可能導(dǎo)致硫苷含量相對(duì)增加。發(fā)酵48 h后酶解的硫苷、植酸含量均處于最低水平，因此選擇48 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)硫苷植酸含量變化的影響

將發(fā)酵的菜粕繼續(xù)酶解后，硫苷和植酸進(jìn)一步被降解，結(jié)果如表2所示。經(jīng)過(guò)6 h酶解后，相比于黑曲霉單獨(dú)發(fā)酵48 h，植酸含量降低了69.88%；酶解12 h后，植酸含量從1.40%降低至0.1%以下，王曉東等[22]使用黑曲霉單步固態(tài)發(fā)酵菜粕將植酸從2.81%降低至0.63%，本研究結(jié)果優(yōu)于王曉東等[22]的研究結(jié)果。酶解前12 h，硫苷降解速率較快，12 h后降解速率相對(duì)減慢。可能是由于12 h后，可降解的底物濃度減少且45 ℃保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使相關(guān)酶酶活下降，從而導(dǎo)致硫苷降解速率下降。當(dāng)經(jīng)過(guò)24 h酶解后，硫苷含量降低至12.13 μmol/g，且不隨酶解時(shí)間增加而變化(P>0.05)。

表2 酶解時(shí)間對(duì)降解硫苷、植酸含量的影響Table 2 Effect of enzymatic hydrolysis time on degrading glucosinolates and phytic acid

發(fā)酵過(guò)程中，黑曲霉產(chǎn)生的植酸酶可能受到溫度及底物平衡等條件限制導(dǎo)致植酸降解效果不好。當(dāng)酶解溫度升高時(shí)，植酸酶分解植酸的能力也有較顯著的提高，且植酸的降解不受黑曲霉生長(zhǎng)代謝影響，因而使得大量植酸易在短時(shí)間內(nèi)被分解。與降解植酸不同，可能在黑曲霉固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的分解硫苷的酶類有限[23]，因此在酶解過(guò)程中不能將硫苷完全降解。再經(jīng)過(guò)24 h酶解后硫苷和植酸含量均不再發(fā)生變化，因而選擇酶解24 h為最佳酶解時(shí)間。由于經(jīng)酶解后，植酸幾乎完全降解，因此后續(xù)研究主要通過(guò)優(yōu)化菌酶協(xié)同條件進(jìn)一步降解硫苷，同時(shí)提高小肽含量。

2.3 底物組成對(duì)降解硫苷提高小肽含量的影響

麩皮作為一種良好的碳源及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適量混入菜粕中能使底物變得疏松透氣，有利于黑曲霉在發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)產(chǎn)酶[24]。如圖1-a所示，麩皮∶菜粕=2∶8和3∶7時(shí)，黑曲霉發(fā)酵酶解后硫苷含量差異不顯著(P>0.05)，且當(dāng)麩皮∶菜粕=3∶7時(shí)，菜粕中的小肽含量最高(P<0.05)。如圖1-b所示，麩皮∶菜粕=3∶7時(shí)，黑曲霉發(fā)酵后蛋白酶活最高，因此麩皮∶菜粕=3∶7可能是黑曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)酶最適碳氮比。因?yàn)辂熎ぁ貌似?3∶7時(shí)黑曲霉產(chǎn)蛋白酶活最高，所以酶解后小肽含量也最高。當(dāng)麩皮比例超過(guò)底物的40%后，可能因?yàn)辂熎さ奶砑恿吭龃笫沟冒l(fā)酵底物中硫苷及可降解的大分子蛋白質(zhì)含量相對(duì)減少，導(dǎo)致硫苷及小肽含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜上，麩皮∶菜粕=3∶7有利于降解硫苷及提高小肽含量和產(chǎn)酶量，因此確定麩皮與菜粕的比例為3∶7。

圖1 底物組成對(duì)硫苷、小肽含量及蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of substrate composition on glucosinolates,small peptide content and protease activity

2.4 添加表面活性劑對(duì)降解硫苷，提高小肽含量的影響

在菜粕與麩皮的混合底物中加入適量的吐溫80有利于提高蛋白酶酶活和小肽含量，結(jié)果如圖2-a所示。當(dāng)在麩皮菜粕混合底物中添加0.05%的吐溫80進(jìn)行發(fā)酵酶解后，小肽含量明顯增加，相比于未添加吐溫80，小肽含量提高了42.66%，但硫苷含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，可能由于菜粕中剩余的硫苷種類無(wú)法被此株黑曲霉產(chǎn)生的酶分解，因此硫苷含量變化不大。圖2-b結(jié)果表明，小肽含量變化與蛋白酶活變化趨勢(shì)相似。黑曲霉在含有0.05%～0.2%吐溫80的混合底物發(fā)酵后，酸性蛋白酶顯著提高，再經(jīng)酶解后，菜粕中大分子蛋白質(zhì)進(jìn)一步被分解為小分子肽，因此小肽含量顯著提高。由于添加0.05%～0.2%的吐溫80對(duì)小肽及硫苷含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，因此確定吐溫80最適添加量為0.05%。

圖2 吐溫80添加量對(duì)硫苷、小肽含量及蛋白酶活的影響Fig.2 Effect of addition of tween 80 on glucosinolates,small peptide content and protease activity

2.5 初始發(fā)酵水分對(duì)降解硫苷提高小肽含量的影響

如圖3-a所示，當(dāng)初始發(fā)酵水分低于67%時(shí)，小肽含量隨水分增加而增加，當(dāng)水分超過(guò)67%時(shí)，小肽含量明顯下降(P<0.05)。初始水分在55%～71%，經(jīng)發(fā)酵酶解后，硫苷含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。圖3-b結(jié)果表明，初始水分的變化對(duì)蛋白酶活的影響不顯著(P>0.05)，且酶解后，小肽含量的變化與蛋白酶活的變化趨勢(shì)不同。根據(jù)WANG等[25]報(bào)道，菜粕中的蛋白質(zhì)被纖維素形成的結(jié)構(gòu)所包裹，在酶解過(guò)程中，小肽的產(chǎn)生可能也受纖維素酶影響。因此當(dāng)水分過(guò)高時(shí)，纖維素酶活力下降(圖3-b)，導(dǎo)致酶解后小肽含量下降。雖然黑曲霉于67%的初始水分發(fā)酵酶解后小肽含量最高，但由于水分過(guò)高，底物結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，且易污染雜菌，不利于擴(kuò)大生產(chǎn)，因此確定最佳的初始發(fā)酵水分為59%～63%，為方便后續(xù)試驗(yàn)，確定最佳初始發(fā)酵水分為60%。

圖3 初始發(fā)酵水分添加量對(duì)硫苷、小肽含量及蛋白酶、CMC酶酶活的影響Fig.3 Effect of initial fermentation moisture on glucosinolates,small peptide content and protease,CMCase activity

2.6 滅菌和不滅菌對(duì)發(fā)酵酶解后營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響

表3結(jié)果表明，黑曲霉在滅菌與不滅菌的菜粕麩皮混合培養(yǎng)基(初始發(fā)酵水分60%、吐溫80添加量0.05%)中發(fā)酵酶解后，除小肽含量外，硫苷、植酸、粗蛋白含量均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表3 滅菌與不滅菌對(duì)發(fā)酵酶解后營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響Table 3 Effect of non-sterile and sterile conditions on antinutritional and nutritional components

同時(shí)結(jié)果表明，未滅菌發(fā)酵對(duì)硫苷、植酸的降解及小肽含量的提高效果均優(yōu)于滅菌后發(fā)酵，推測(cè)由于滅菌后導(dǎo)致培養(yǎng)基中部分營(yíng)養(yǎng)成分流失，使得黑曲霉發(fā)酵效果變差。最終經(jīng)未滅菌的麩皮菜粕混合培養(yǎng)基發(fā)酵酶解后，硫苷含量從31.38 μmol/g降解為11.31 μmol/g，植酸含量從34.45 mg/g降低至1 mg/g以下，小肽含量提高至21.19%，占粗蛋白含量的49.92%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)發(fā)酵、酶解時(shí)間，發(fā)酵酶解、產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，確定了最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵時(shí)間、酶解時(shí)間分別為48 h、24 h，菜粕與麩皮比例、吐溫80添加量、初始發(fā)酵水分分別為7∶3、0.05%、60%。與單步固態(tài)發(fā)酵相比，經(jīng)菌酶協(xié)同處理的菜粕，硫苷、植酸含量分別降低了33.20%、96.18%；與空白對(duì)照相比，硫苷、植酸含量分別降低了63.96%、97%以上；同時(shí)，菜粕中小肽含量提高至21.19%，相比于空白和單步發(fā)酵分別提高了74.98%和673.36%。綜上，菌酶協(xié)同處理菜粕后，有效降低了菜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子硫苷、植酸含量，大幅提高了小肽含量，對(duì)擴(kuò)大菜粕蛋白的使用具有重要意義。