周琦，談安群，易鑫，李貴節(jié),3*，程玉嬌，譚祥，ROUSEFF RUSSELL LEE ，吳厚玖，翟雨淋，廖洪波，王華*

1(西南大學(xué)柑桔研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)2(國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)3(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067)4(西南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，重慶，400715)5(重慶市質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化研究院，重慶，400023)

橙汁因其酸甜可口的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價值而廣受消費(fèi)者喜愛。截止2017年，我國柑橘汁的出口量和出口金額分別達(dá)4 740.64 t和1 080.75萬美元，其中橙汁出口占75%以上[1]。隨著消費(fèi)者權(quán)利意識的增長，全球消費(fèi)者普遍對橙汁原料標(biāo)簽的真實性較為關(guān)注。相關(guān)國際組織已出臺相應(yīng)法律法規(guī)予以規(guī)范，如國際食品法典委員會在法典247—2005中規(guī)定甜橙汁中允許摻入少量其他柑橘汁以調(diào)配其色澤、口感和風(fēng)味，但其量不得超過橙汁可溶性固形物總量的10%，并需予以明確標(biāo)注[2]；然而我國尚未對調(diào)配橙汁允許摻入的比例做出明確規(guī)定。過度調(diào)配會降低橙汁的品質(zhì)，影響消費(fèi)者的購買體驗，損害消費(fèi)者的利益。除此之外，還有少數(shù)不良商家將廉價的果渣提取液與橙汁按照一定比例混合來充當(dāng)100%天然橙汁，或用質(zhì)量低劣的果實原料冒充品質(zhì)上乘的甜橙果實，甚至摻水稀釋、再利用甜味色素回味補(bǔ)色謊稱純品橙汁。

常規(guī)的品質(zhì)鑒別手段主要是國標(biāo)法，其規(guī)定了橙汁及橙汁飲料相應(yīng)的感官要求和理化指標(biāo)，并公布了不同種類橙汁各組分(可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-異檸檬酸和總黃酮)含量的標(biāo)準(zhǔn)值和權(quán)值。但這種方法需要測定的組分種類繁多、分析復(fù)雜、可變性因素大且引入的誤差也較大[3]?；诖耍瑖鴥?nèi)外研究者開發(fā)了色譜-質(zhì)譜串聯(lián)檢測等新型鑒別方法對橙汁的品質(zhì)進(jìn)行識別[3-6]。BOCHAROVA等[7]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和稀釋法對橙汁中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析比較，建立了工業(yè)橙汁稀釋指標(biāo)與鮮榨橙汁稀釋指標(biāo)的比較評價數(shù)據(jù)庫，有助于對鮮榨橙汁的品質(zhì)進(jìn)行快速鑒別；CUEVAS等[8]采用高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜(high performance liquid chromatography -high resolution mass spectrometry,HPLC-HR-MS)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)對商品橙汁的代謝組學(xué)指紋圖譜和醛類、酯類等揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，建立了可選類別模型，初步實現(xiàn)了對有機(jī)橙汁和傳統(tǒng)橙汁的鑒別。此外，張淼等[9]利用電子舌對含不同比例的橙汁飲料的鮮榨橙汁進(jìn)行口味識別，發(fā)現(xiàn)隨著摻入比例的提高，樣品分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，證明了電子舌技術(shù)能夠有效地用于橙汁真實性的鑒別中；劉偉紅等[10]采取改良十六烷基三甲基溴化銨法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)對果汁中DNA進(jìn)行提取，利用UGT基因引物對柑橘屬植物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，證明了UGT基因特征性引物可用于橙汁的鑒偽研究中。目前橙汁品質(zhì)鑒定的研究方向已經(jīng)聚焦于柑橘汁中特征性數(shù)據(jù)庫的建立[11]，但該方法需依托質(zhì)譜等昂貴儀器，鑒別成本高且耗時長。

多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones,PMFs)是柑橘中特有的一類黃酮類物質(zhì)，其分子含有多個甲氧基，極性較低，具有抗炎、抗氧化、抗突變、抗癌等生物活性[12-15]。近幾年，國內(nèi)外研究者開發(fā)了多種測定柑橘汁中黃酮的方法[16-17]。已有研究表明甜橙和寬皮柑橘中的PMFs種類與含量具有一定的區(qū)別[18]，因此通過分析兩者之間的差異或成為鑒別橙汁中是否含有寬皮柑橘汁的可能途徑。本研究通過常規(guī)HPLC檢測，利用主成分分析(principal component analysis,PCA)建立常見甜橙汁與寬皮柑橘汁中的多甲氧基黃酮的鑒別模型，對摻入寬皮柑橘汁的橙汁樣品進(jìn)行識別，以期橙汁品質(zhì)的鑒別提供一種簡便、高效、低成本的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

成熟甜橙果實和寬皮柑橘果實，采自豐都、忠縣、江津等柑橘園和西南大學(xué)柑桔研究所國家果樹種植柑橘資源圃。

1.1.2 試劑與耗材

甲醇、乙腈、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)為色譜純，美國Honeywell公司；乙酸乙酯、磷酸為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：異甜橙黃酮、四甲氧基異野黃芩素、四甲氧基野黃芩素、七甲氧基黃酮、5-脫甲基川陳皮素，上海源葉生物公司；甜橙黃酮、川陳皮素，加拿大TRC；桔皮素，美國ChromaDex；以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均≥98%。

Sep-Pak Plus C18固相萃取柱，美國沃特世公司；0.22 μm有機(jī)相針式濾器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜系統(tǒng)(配備二極管陣列檢測器和熒光檢測器)，安捷倫科技有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；SB-5200 DTN超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；DouR@SPT-H型氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；VacMaster負(fù)壓固相萃取系統(tǒng)，瑞典Biotage公司；H-100-DWBWIA01原汁機(jī)，惠人新生活文化傳媒有限公司；SQP十萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理及樣品制備

采摘新鮮成熟的果實，去皮榨汁，經(jīng)過100目紗網(wǎng)過濾后裝瓶備用。吸取12 mL搖勻的果汁，在4 ℃以13 400×g離心10 min，分別收集上清液和沉淀。

上清液萃?。簠⒖糒I等[19]的方法，稍作修改。固相萃取柱依次通過5 mL甲醇和5 mL蒸餾水，使填料活化和平衡，然后將果汁樣品上清液緩慢通過萃取柱，再用28%乙腈水溶液除去酚酸、黃烷酮類和類胡蘿卜素等雜質(zhì)，最后用乙酸乙酯洗脫收集。洗脫液用N2流在40 ℃下吹干，用1 mL甲醇復(fù)溶，通過有機(jī)相針式濾膜過濾，注入液相色譜自動進(jìn)樣瓶備用。

果肉沉淀萃取：參照DUGO等[20]萃取柑橘中氧雜環(huán)成分的方法，加入乙腈旋渦振蕩30 s，然后室溫超聲(P=300 W)5 min，吸取上清液，以上操作重復(fù)3次。合并收集的萃取液，用N2流吹干后再用1 mL甲醇復(fù)溶，通過有機(jī)相針式濾膜，注入自動進(jìn)樣瓶備用。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱為安捷倫Poroshell 120 EC-C8柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)，并配備相同型號的填料保護(hù)柱；流動相流速為1 mL/min，梯度見表1；二極管陣列檢測器(DAD)波長掃描范圍為210～550 nm，熒光檢測器(FLD)激發(fā)波長掃描范圍為250～400 nm，發(fā)射波長掃描范圍為360～550 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL。

表1 流動相梯度 單位：%Table 1 Mobile phase gradient

注：A-0.025%磷酸水溶液；B-甲醇；C-乙腈；D-THF/A=1∶4。

1.3.3 樣品多甲氧基黃酮的定性與定量分析

樣品中目標(biāo)PMFs的定性檢測通過紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和保留時間三者結(jié)合來進(jìn)行判定[21]。樣品PMFs定量檢測采用外標(biāo)法，UV定量波長為330 nm，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 365處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多甲氧基黃酮的分離和檢測

PMFs混標(biāo)的UV和FL信號的色譜圖如圖1所示。由圖可知，8種目標(biāo)PMFs分離度良好，均在23 min后出峰；前端留空，該部分是果汁經(jīng)SPE處理后未除盡的少量酚酸、黃烷酮及香豆素等干擾物，留空有效避免了干擾物與目標(biāo)PMFs共流出。各物質(zhì)的外標(biāo)定量工作曲線和線性關(guān)系見表2，線性關(guān)系良好(R2≥0.998)。

圖1 多甲氧基黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 HPLC Chromatogram of polymethoxyflavone mixed standards

表2 多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收定量回歸方程Table 2 Regression equation of ultraviolet absorption for polymethoxyflavone standard substances

2.2 兩類果汁中PMFs的分布特點及含量

以長葉香橙和椪柑為例，典型的甜橙汁與寬皮柑橘汁中多甲氧基黃酮的色譜圖如圖2所示。8種PMFs在兩類果汁中都有分布且川陳皮素(4)峰面積均為最大。除川陳皮素外，甜橙汁中甜橙黃酮(2)所占比例最高，四甲氧基野黃芩素(5)、七甲氧基黃酮(6)含量次之，而寬皮柑橘汁中桔皮素(7)所占比例最高，其他PMFs含量較低。該分布情況與DUGO[20]的測定結(jié)果相類似。

常見品種的甜橙和寬皮柑橘果汁中PMFs的含量分別如表3和表4所示。甜橙汁中異甜橙黃酮(1)的含量最高為0.222 mg/mL(渝早橙)，而寬皮柑橘汁中異甜橙黃酮含量最低為0.31 mg/mL(2003-4號)，最高可達(dá)1.357 mg/mL(麗紅)，可見寬皮柑橘汁中異甜橙黃酮含量均高于甜橙汁。此外，寬皮柑橘汁中四甲氧基異野黃芩素(3)、川陳皮素(4)和桔皮素(7)的含量也普遍高于甜橙汁，而甜橙黃酮(2)的含量則相反。

2.3 樣品PMFs的主成分分析

將22個甜橙和28個寬皮柑橘共計50個果汁樣品以8個多甲氧基黃酮為變量進(jìn)行主成分分析，其中樣品數(shù)遠(yuǎn)大于變量數(shù)，結(jié)果如圖3和圖4所示。

表3 22個常見甜橙汁樣品的多甲氧基黃酮含量Table 3 Content of polymethoxyflavones in 22 samples of typical sweet orange juices

注：結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，保留小數(shù)點后3位，單位mg/mL；ND為未檢出。

表4 28個常見寬皮柑橘汁樣品的多甲氧基黃酮的含量Table 4 Content of polymethoxyflavones in 28 samples of typical mandarin juices

注：寬皮柑橘均采于中柑所，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，保留小數(shù)點后3位，單位mg/ml；ND為未檢出。

圖3 甜橙汁與寬皮柑橘汁主成分分值圖Fig.3 Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin orange juice注：左圖中三角形符號代表甜橙樣品，圓點符號代表寬皮柑橘樣品；右圖1～8為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)序號

圖4 柑橘汁樣品Hotelling’s T2檢驗結(jié)果及主成分累積可釋方差Fig.4 Hotelling's T test results and cumulative interpretable variance of the principal components of orange juice samples

由圖3的二維分值圖(上)可見，甜橙汁樣品點與寬皮柑橘汁樣品點分別匯聚，2個集合間差異明顯；由相關(guān)性載荷圖(下)可見，四甲氧基野黃芩素(5)和甜橙黃酮(2)在PC-1上的相關(guān)度分量達(dá)到0.8～0.9，而川陳皮素(4)、5-脫甲基川陳皮素(8)、異甜橙黃酮(1)、四甲氧基異野黃芩素(3)和桔皮素(7)在PC-2上的相關(guān)度分量在0.8～1.0之間，即2組PMFs分別在Y+和X+方向上有較大貢獻(xiàn)；分值圖和載荷圖的空間關(guān)系相對應(yīng)。由上述結(jié)果可知，PMFs在甜橙汁和寬皮柑橘汁中的分布具有特征性組合，能夠通過PCA對兩類果汁進(jìn)行區(qū)分；而在兩類樣品集合之間的樣品點則同時具有甜橙和寬皮柑橘的PMFs組合特征。由圖4可知，Hotelling’sT2檢驗僅有少數(shù)離群點，PC-1和PC-2對總方差的貢獻(xiàn)度達(dá)到81%，檢驗曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線無較大差異，說明模型能夠很好的反映原始樣本的特征。

2.4 甜橙汁中摻入寬皮柑橘汁的鑒別

利用2.3所得判別模型對摻入寬皮柑橘汁的甜橙汁進(jìn)行鑒別驗證。在市場上購買價格低廉的椪柑與高品質(zhì)、高售價的長葉香橙，分別榨汁后，按5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65的體積比例混合，每個調(diào)配比例進(jìn)行3次平行試驗。按照1.3.1前處理方法和1.3.2液相色譜法測定多甲氧基黃酮種類及含量，將各組調(diào)配果汁樣品的PMFs含量平均值數(shù)據(jù)代入PCA判別空間中進(jìn)行鑒別。由圖5可知，含有5%椪柑汁的樣品接近甜橙汁類群的邊界；隨著摻入比例的升高，調(diào)配橙汁樣品點越來越接近并深入寬皮柑橘汁類群，其中含10%椪柑汁的樣品已明顯脫離甜橙汁范圍，而趨近于寬皮柑橘汁邊界。由此可直觀地將摻入比例≥10%的調(diào)配橙汁予以鑒別，從而判定產(chǎn)品是否符合國際食品法典委員會的規(guī)定。同理也可判斷其他常見品種寬皮柑橘汁和橙汁的調(diào)配樣品。需特別說明，某些甜橙和寬皮柑橘雜交品種(即雜柑，如：不知火橘橙、莫科特橘橙和清見橘橙等)的多甲氧基黃酮分布特征介于兩者之間，它們在上述判別空間中的分值點可能會落在甜橙和寬皮柑橘集合之間，但由于這些雜柑鮮食口感較好，鮮果售價高，所以其果汁被誤判為超量調(diào)配橙汁的現(xiàn)實可能性幾乎不存在。

圖5 不同比例寬皮柑橘汁摻入甜橙汁的判別Fig.5 Discrimination of sweet orange juice mixed with different proportion of mandarin orange juice

3 結(jié)論

采用C18固相萃取和乙腈分別對柑橘汁上清液和果肉微粒進(jìn)行充分萃取和濃縮，利用高效液相色譜法測定了甜橙汁與寬皮柑橘汁中8種目標(biāo)多甲氧基黃酮的含量；通過主成分分析建立了摻入寬皮柑橘汁的調(diào)配甜橙汁的鑒別模型。將椪柑汁以不同體積比例摻入長葉香橙汁中進(jìn)行鑒別試驗，結(jié)果顯示鑒別模型能夠?qū)w積分?jǐn)?shù)10%及其以上椪柑汁的調(diào)配橙汁實現(xiàn)有效判別。該方法簡便易行，對儀器設(shè)備要求較低，可適用于甜橙汁中是否摻入過量的寬皮柑橘汁。