楚勝，李傳俊

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462000）

0 引言

枳椇(Hovenia) 屬鼠李科(Rhamnaceae) 枳椇屬(Hovenia)植物干燥成熟的種子，學(xué)名枳椇子，枳椇在1500 多年前我國已作為藥用，載于《唐本草》，藥用部分為帶有肉質(zhì)果柄的果實或種子。至近現(xiàn)代,藥用部位從枝木及花序軸發(fā)展到果實和種子,而功效基本一致[1]。《本草綱目》中記述：枳椇功用同蜂蜜；可解酒毒，辟蟲毒。

當(dāng)今社會，社交場合，存在普遍飲酒現(xiàn)象。長期飲酒導(dǎo)致體內(nèi)放生酒精慢性蓄積，作為酒精代謝的主要場所，發(fā)生酒精性肝損傷的勢頭很猛[2]。為了減輕長期飲酒者酒精對肝損傷影響，本文通過建立小鼠慢性酒精性肝損傷模型，觀察給予枳椇水提物灌胃慢性酒精性肝損傷模型小鼠生化指標(biāo)的變化以及肝組織脂肪變性程度，研究枳椇水提物對慢性酒精性肝損傷模型小鼠的作用，為因飲酒導(dǎo)致的肝損傷者尋找具有保肝護肝功效的藥食物提供一些建議。

1 實驗材料與儀器

1.1 試劑

超氧化物歧化酶(SOD)測試試劑盒、丙二醛(MDA)測試試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測試試劑盒、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測試試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；56 度白酒，北京紅星股份有限公司；生理鹽水，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；枳椇水提液：低劑量（1 mg/mL）、中劑量（2 mg/mL）、高劑量（4 mg/mL）；蘇丹Ⅲ染色劑。

1.2 動物

購買昆明種雄性小鼠，飼養(yǎng)于漯河醫(yī)專動物房，飼養(yǎng)期間控制溫濕度，溫度20～26 ℃，相對濕度為35%～70 %。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1005，鄭州紫拓儀器設(shè)備有限公司；BLOBASE-EL10A 多功能酶標(biāo)儀，濟南高奎醫(yī)療器械有限公司；Happy-TL16 臺式離心機，濟南福的機械有限公司；超凈工作臺，東莞雅寧公司；顯微鏡YRS-32，上海遠仞檢測設(shè)備有限公司；KD-2850 冷凍切片機，北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器公司。

2 方法

2.1 實驗方法

2.1.1 枳椇水提液

枳椇碾成粗粉，用水浸提24 h,浸提液保存待用；濾渣加水煎煮兩次,過濾合并兩次濾液；提合并浸提液、煎煮液后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，濃縮為濃縮液，置于冰箱內(nèi)備用。實驗前取適量濃縮液加水稀釋成含枳椇1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 水提液，待用。

2.1.2 慢性酒精性肝損傷實驗

選取昆明種雄性小鼠40 只，稱重（25±2）g，隨機分成五組，枳椇水提液低、中、高劑量組、模型組和正常組，每組8 只。實驗用小鼠除正常對照組外，其他組小鼠按任彬彬等[3]造模方法，每日用56 度白酒灌胃，劑量10 mL/kg，連續(xù)3 周。慢性酒精性肝損傷模型建模成功，開始實驗，枳椇水提物低劑量組、枳椇水提物中劑量組、枳椇水提物高劑量組分別用1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 的枳椇水提液罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，連用15 d；正常組和模型組用純化水罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，連用15 d。最后一次罐胃2 h 后開始進行生化指標(biāo)檢測。

2.2 實驗指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 實驗指標(biāo)

選取小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及肝組織脂肪變性評分作為本實驗的指標(biāo)。

2.2.2 實驗指標(biāo)檢測

摘除小鼠眼球取血，靜置，離心機3000/min，離心15 min 后取出血清，按試劑盒說明書要求操作，定量測定各組小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，結(jié)果詳見表1、表2。

2.2.3 肝組織病理學(xué)檢查

取肝葉冷凍切片，蘇丹Ⅲ染色劑，40×10 顯微鏡下觀察脂滴分布、范圍，進行肝組織病理學(xué)檢查評分。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響

表1 表明：不同劑量組與模型組組間比較，低劑量組ALT（P＜0.05）與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，ATS（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量組ALT（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，ATS（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組ALT（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，ATS（P＜0.05）與模型組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響

表2 表明：不同劑量組與模型組組間比較，低劑量組MAD、SOD 指標(biāo)P 值均大于0.05，與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量組MAD（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，SOD（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組中劑量組MDA（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，SOD（P＜0.05）與模型組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

蘇丹Ⅲ染色，顯微鏡下染成觀察橘紅色的脂滴，按照評分標(biāo)準(zhǔn)（橘紅色的脂滴散在、稀少為0分；含橘紅色的脂滴≤1/4 為1 分；含橘紅色的脂滴≤1/2 為2 分；含橘紅色的脂滴≤3/4 為3 分；含橘紅色的脂滴＞3/4 為4 分）。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，模型組與正常組有非常顯著統(tǒng)計學(xué)差異，說明動物建模成功；各劑量組與模型組比較，高劑量組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，表明高劑量組緩解慢性酒精性肝損傷小鼠肝組織脂肪的變性。

表3 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠肝組織脂肪變性的影響（n=8,±s）

表3 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠肝組織脂肪變性的影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

4 討論

4.1 動物建模及實驗指標(biāo)

模型組與對照組比較，生化指標(biāo)ALT、ATS、MAD和SOD，以及肝組織病理學(xué)檢查評分指標(biāo)均有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＜0.01），說明慢性酒精性肝損傷小鼠建模成功，表明實驗中采用的任彬彬、李國莉、劉賀榮等[3]造模方法是有效的方法。

表1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響（n=8,±s）

表1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

表2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響（n=8,±s）

表2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

飲酒者飲久后，進入機體的酒精可以引起體內(nèi)AST、ALT 含量升高[4-5]；酒精的代謝主要器官是肝，進入肝組織的酒精能引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而影響肝功，而MDA 又是肝細胞膜脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物之一，故可以用肝組織中MDA 含量間接反映肝損傷的受損程度[6]；SOD 阻止肝損傷、修復(fù)損傷肝細胞，故SOD 活性可以反映肝受損速度及受損肝細胞修復(fù)能力[7]。綜上，本實驗選取血清ALT、AST 和MDA 含量及SOD 活性作為檢測肝損傷的生化指標(biāo)[8]。

4.2 枳椇水提液對酒精性急性肝損傷小鼠保護作用

肝臟是酒精的主要代謝場所，因為只有肝臟內(nèi)才具有代謝酒精的特有酶類。酒精在機體代謝主要有3 條途徑：

（1）胞質(zhì)內(nèi)酒精脫氫酶（ADH）途徑

CH3CH2OH+氧化型輔酶Ⅰ→CH3CHO+還原型輔酶I+H+

（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體酒精氧化(MEOS)途徑

CH3CH2OH+氧化型輔酶Ⅱ+O2+H+→CH3CHO+還原型輔酶Ⅱ+2H2O

（3）過氧化小體上過氧化氫酶(CAT)途徑

CH3CH2OH+過氧化氫→CH3CH2O+2H2O

三種路徑酒精均被氧化成為乙醛，乙醛濃度過高損害肝臟并顯著降低肝臟對氧的利用，并加劇自由基介導(dǎo)的不良反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化作用。另外，酒精代謝產(chǎn)生還原型輔酶I、還原型輔酶Ⅱ影響糖代謝，產(chǎn)生氧自由基，引起肝細胞損傷[9-10]。模型組小鼠肝組織的MDA 升高非常顯著，SOD 活性降低也非常顯著。

枳椇水提液具有顯著增強小鼠肝臟乙醇脫氫酶活性的作用[11]，加快機體內(nèi)酒精代謝，降低酒精對肝臟的損傷。枳椇含有山奈酚、雙氫山奈酚、洋芹素、楊梅黃素、榭皮素等多個黃酮類化合物[12-13]，其有抗氧化、清除自由基的作用。實驗中枳椇水提液能夠降低肝損傷小鼠肝臟內(nèi)氧自由基，降低MDA 含量，提高SOD 活性，可能與枳椇含有的黃酮類成分有關(guān)。

小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，高劑量組緩解慢性酒精性肝損傷小鼠肝組織脂肪的變性。枳椇子含有枳椇皂苷A1、A2、B1、B2等皂苷雷成分，枳椇皂昔能明抑制組胺釋放[14]，故降低了肝臟的炎性反應(yīng)，從而減輕或減緩肝臟的損傷。枳椇子水提取液能顯著提高肝細胞存活時間和增殖率，對肝細胞具有促生長活性[15]，進而減緩肝臟脂肪變性，加快受損肝細胞的修復(fù)。

綜上所述，枳椇水提液高劑量組對酒精性肝損傷具有保護作用，有利于酒精性肝損傷者肝細胞修復(fù)，值得在實踐中應(yīng)用。但枳椇對于受損肝臟的保護作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不夠清晰明確，建議繼續(xù)探討研究。