崇立明，楊 陽，王忠輝，姜 娟，賈玉玲，周 莉，孫祖越

（1.上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心，上海200032；2.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海200032；3.復旦大學生殖與發(fā)育研究院，上海200032）

藥物生殖毒性試驗研究是藥物非臨床安全性評價的重要內容，是藥物進入臨床研究及上市的重要環(huán)節(jié)。其中胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗（即Ⅱ段生殖毒性試驗）是新藥非臨床安全性評價中評價外源性因素是否具有致畸作用的標準方法，多年來很多國家和機構，如人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會（International Council for Harmonization，ICH）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）等都采用或推薦這一方法，是評價新藥生殖毒性時的首選方法。

根據(jù)我國CFDA和ICH（S5）的指導原則［1-2］，胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，除了嚙齒類動物推薦用大鼠外，一般還需要采用第2 種哺乳動物。由于已積累了豐富的家兔背景資料，且容易獲得和使用，因此家兔為優(yōu)先選用的非嚙齒類動物。為此，本文總結了本研究室2011-2018年所完成的10余項兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗，對溶媒對照組共計149只孕兔和1097 只胎仔的數(shù)據(jù)進行收集和統(tǒng)計分析，初步建立了本研究室兔胚胎-胎仔發(fā)育指標的背景資料，該資料對研究室間方法可靠性比對，以及研究結果的解釋均非常重要，同時也為生殖毒理學安全評價的開展和結果判斷提供重要數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物

新西蘭兔，3～5 月齡，普通級，主要購自上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司和上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0007 和SCXK（滬）2012-0011。新西蘭兔飼養(yǎng)在上海市計劃生育科學研究所（中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心）普通級小動物房，室溫16～26℃，相對濕度40%～70%，光照12～14 h，黑暗10～12 h；新西蘭兔單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠內，自由飲水、攝食，實驗開始前動物適應性飼養(yǎng)至少7 d。

1.2 儀器

DS-671電子天平和MS4002TSDR/00電子天平（Mettler Toledo，瑞士）；Motic 體式顯微鏡（日本Olympus Corporation）。

1.3 孕兔妊娠和胎仔生長發(fā)育指標檢測

動物交配：挑選發(fā)情雌兔放入雄兔籠內，為保證交配成功，根據(jù)情況每次可以雌∶雄=1∶2 比例交配，交配間隔時間在2～3 h，或采取同一雄兔交配時間隔約15～16 h交配第2次，如有必要，實施人工助配。雌兔交配完畢后移出雄兔籠。

孕兔：①體質量：妊娠第0 天（gestation day，GD0），GD3，GD6，GD10，GD13，GD15，GD18，GD20，GD24和GD28測定體質量并記錄；②剖宮檢查：GD28安樂死母兔，檢查黃體數(shù)、胎重（連子宮）、胎盤重、胎盤外觀、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)。

胎仔：①性別、胎重、頂臀長和尾長；②外觀檢查：對每只胎仔先經(jīng)肉眼檢查，如肉眼不能確定某種畸形時，將胎仔放在解剖顯微鏡下進一步確定；有無腦積水、露腦、腦疝、腦膜膨出、無眼、小眼、無耳和腭裂；有無多趾、并趾、少趾、無趾、足內翻和短趾；有無臍疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂和脊柱側突；有無短尾、卷尾、無尾和尾分叉；有無肛門閉鎖；③骨骼檢查：頭顱是否完整，骨化程度；有無胸骨節(jié)缺失、骨化不全、雙骨化點、胸骨節(jié)錯位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋；有無四肢骨化不全、粗短、畸形、多趾和少趾等；④內臟器官檢查：有無腭裂、舌異常、鼻道擴大、單鼻道、腦水腫、腎積水；眼球是否正常；心、肝、脾、肺、腎和子宮等臟器大小和位置是否異常［3-4］。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對各項指標數(shù)據(jù)進行處理，計算±s，確定最小值、最大值、95%可信區(qū)間（CI）和變異系數(shù)（CV）。CV=標準偏差/平均值×100%。

2 結果

2.1 孕兔妊娠期體質量變化

對母體體質量的影響是評價母體毒性的指標之一。在兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中，于GD6～GD18給予受試物，測得孕兔妊娠各時期的體質量數(shù)據(jù)見表1。孕兔GD0體質量為（3.0±0.3）kg，GD28為（3.5±0.4）kg，妊娠期各個時間點變異系數(shù)較低，體質量增加穩(wěn)定（表1）。

Tab.1 Body mass of pregnant rabbits of different gestation days（GD）

2.2 孕兔生殖功能和胎仔生長發(fā)育指標

在胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中，黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)等指標通常是衡量胚胎早期和晚期發(fā)育毒性的指標，胎仔重、胎盤重、頂臀長和尾長同樣也是評價受試物對胎仔是否產(chǎn)生毒性的指標，母體毒性有時會繼發(fā)的胚胎毒性，胚胎發(fā)育遲緩和（或）遲滯，從而造成胎仔的體質量偏低，身體短小。GD28處死孕兔后，取出胎仔，測定胎仔重和胎盤重，測量其頂臀長和尾長，檢測各項指標的數(shù)據(jù)見表2 和表3。研究（表2）可見，174 只雌兔交配成功，有效妊娠數(shù)為149 只，妊娠率為85.6%；剖檢結果顯示，1140 例著床成功，其中活胎1097 例，吸收胎22例，死胎21例；由于個別孕兔妊娠的胎仔數(shù)較少，導致平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)、平均活胎數(shù)和胎重（連子宮）的變異系數(shù)較高，這屬于正常的生理現(xiàn)象。表3 的胎仔發(fā)育指標中，胎仔體質量為（33.4±5.0）g，胎盤重為（4.0±0.8）g，變異系數(shù)偏高，同樣是由于個別孕兔妊娠的胎仔數(shù)少，導致宮內的胎仔發(fā)育較好，胎盤較大；頂臀長和尾長變異系數(shù)較低，表明胎仔的發(fā)育比較穩(wěn)定。

2.3 胎仔外觀、內臟和骨骼檢查指標

對胎仔的外觀、內臟和骨骼進行檢查，可進一步判斷受試物是否對胎仔產(chǎn)生毒性。對每只胎仔先經(jīng)肉眼檢查，如肉眼不能確定某種畸形時，將胎仔放在解剖顯微鏡下進一步確定；100%胎仔進行軟組織和骨骼檢查，采用顯微解剖技術結合固定法進行軟組織檢查；胎仔的骨骼發(fā)育存在變異，包括脊椎骨、胸骨和肋骨的數(shù)量、胸骨節(jié)骨化模式或胸骨節(jié)與肋骨的融合、尾椎的融合等，骨骼的發(fā)育也存在廣泛的可塑性，一般情況下，自然發(fā)生率相對高的群體所發(fā)生的變異趨勢經(jīng)常是可逆的，對動物產(chǎn)生很小的或不產(chǎn)生有害性后果［5］。

從本研究室的研究結果（表4）中見，有2 只胎仔出現(xiàn)外觀異常，分別為露腦（1 例）和卷尾（1 例）；胎仔的內臟檢出1 例腦膜膨出；胎仔的骨骼檢查主要表現(xiàn)為胸骨數(shù)目減少〔第5或（和）6胸骨缺失〕和骨化不全，肋骨和尾椎變異表現(xiàn)為數(shù)目不同。

Tab.2 Reproductive index of pregnant rabbits at the endpoint of the experiment

Tab.3 Growth and development index of fetuses on cesarean section day

Tab.4 Examination result of fetal appearance，skeleton and viscera check

3 討論

胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗是妊娠動物自胚胎著床至硬腭閉合期間接觸受試物，評價受試物對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響，評價內容包括胚胎和胎仔的死亡、生長改變和結構變化等。主要目的在于為母體孕期接觸新藥可能對胎兒造成的影響提供非臨床的試驗依據(jù)。而且，由于新藥臨床試驗一般均不包括孕婦，胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗的結果往往是絕大多數(shù)新藥生殖毒性評價的唯一數(shù)據(jù)來源。

藥物生殖毒性的試驗結果，對于判斷藥物是否產(chǎn)生致畸作用有重要意義，這項結果判斷，與正常動物妊娠和胎仔發(fā)育等生理指標的背景數(shù)據(jù)關系密切。大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗的背景數(shù)據(jù)曾有少量報道［6-8］，但是關于新西蘭兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗的背景數(shù)據(jù)尚未見報道。

背景數(shù)據(jù)實際上就是“參考值”，醫(yī)學參考值是指“正常”人體和動物的各種生理常數(shù)、體液和排泄物中各種成分含量及人體對各種刺激變化的反應值，其可信區(qū)間被定為95%的參考范圍。可以區(qū)分“正?！迸c“異?！眰€體，為臨床診斷提供參考。

兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性的主要判斷標準之一是孕兔妊娠和胎仔發(fā)育等指標（如孕兔體質量、攝食量、黃體數(shù)、胎重、胎盤重、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和著床數(shù)；胎仔性別、胎仔重、頂臀長和尾長等）的變化，而對這些指標的分析、評價需要以實驗室動物的正常參考值，即背景數(shù)據(jù)為基礎。由于實驗動物品系、個體差異、來源、實驗室條件和測定方法等影響因素，文獻中的背景數(shù)據(jù)差異也較大。因此，建立自身實驗室的實驗動物胚胎-胎仔發(fā)育毒性背景數(shù)據(jù)可以為藥物生殖毒性非臨床安全性評價提供準確、可靠、科學的參考依據(jù)。

本文各指標為本研究室近幾年來不同生殖毒性研究數(shù)據(jù)的積累，這些背景數(shù)據(jù)可以為受試物的生殖毒性評價試驗的可靠性提供非常重要的數(shù)據(jù)支撐。本文僅選擇溶媒對照組動物的數(shù)據(jù)，動物也是來自同一地區(qū)，隨著研究的開展，后續(xù)還會有補充更多的背景數(shù)據(jù)，進行動態(tài)研究匯總。另一方面，“正?！迸c“異?！敝笜酥g也存在交叉，出現(xiàn)“假陰性”和“假陽性”。因此，需收集不同的環(huán)境條件、不同生理、病理情況下的數(shù)據(jù)背景資料，經(jīng)過綜合分析，按不同目的將“正常”與“異?！狈诸?，具體問題具體對待，結合動物的整體毒性反應，統(tǒng)一分析，使得對研究結果的評價更加科學、合理并切合實際。