張婷婷，李海劍，武亞玲，海麗娜，4

（1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州450000；2.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，河南 鄭州450000；3.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京100120；4.北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院，北京100871）

中國(guó)是肝癌發(fā)病重災(zāi)區(qū)。全球約85%肝癌新發(fā)病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家，僅我國(guó)的肝癌新發(fā)病例就占世界肝癌病例總數(shù)的50%以上［1］。由于起病隱匿，確診時(shí)多屬中晚期，治療效果較差，預(yù)后惡劣，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康［2］。同時(shí)中晚期肝癌有明顯的侵潤(rùn)性生長(zhǎng)與血管侵犯，從而導(dǎo)致腫瘤病灶的彌散性生長(zhǎng)與廣泛轉(zhuǎn)移［3］。復(fù)方苦參注射液（Compound Kushen Injection，CKI）是由苦參（Sophora flavescens Ait.）和白土苓（Heterosmilax yunnanensis Gagnep.）精制而成。中醫(yī)認(rèn)為，苦參具有清熱燥濕之功效?？鄥⒑锌鄥A（matrine）、氧化苦參堿（oxymatrine）、槐果堿（sophocarpine）和氧化槐果堿（oxalate）等多種活性成分［4-5］。臨床上CKI 用于多種惡性腫瘤（如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等）的輔助治療［6-8］。但CKI 在肝癌治療中的作用，以及對(duì)腫瘤遷移和侵襲能力的影響尚不明確。為此，本研究通過體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7221細(xì)胞，觀察CKI 對(duì)其遷移和侵襲能力的抑制作用，并探討其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，為其進(jìn)一步研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

CKI 購(gòu)自山西振東制藥股份有限公司（批號(hào)：20160506，總生物堿含量20 g·L-1）；MTT，美國(guó)Sigma公司；Matrigel基質(zhì)膠，美國(guó)BD公司；DMEM培養(yǎng)液，美國(guó)Gibco 公司；Transwell 小室，美國(guó)Corning 公司；兔抗人NF-κB 單抗，兔抗人GAPDH單抗和HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗，美國(guó)CST 公司；胎牛血清RNA 提取試劑盒，德國(guó)Qiagen 公司；SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒（貨號(hào)：DRR820A），日本TaKaRa公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑研究所。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；SYBR Green PCR 預(yù)混液，美國(guó)Thermo 公司；iCycle 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)、電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7221細(xì)胞，購(gòu)于美國(guó)ATCC，復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)傳代。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

將SMMC-7221細(xì)胞以1×107L-1的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每組5個(gè)平行孔，設(shè)空白孔。接種24 h后，加入終百分比為0.0%（細(xì)胞對(duì)照組）、2.5%、5.0%和10.0%CKI繼續(xù)培養(yǎng)24 h。而后每孔加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加150 μL DMSO，30 min 后用酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)定各孔吸光度（A570nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570nm-空白組A570nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A570nm-空白組A570nm）×100%。

1.4 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移

將SMMC-7221 細(xì)胞以1×108L-1的密度接種于24孔板中過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，用無菌槍頭均勻畫5條橫線，然后用PBS洗細(xì)胞3遍，去除劃痕過程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入終百分比為2.5%，5.0%和10.0%CKI溶液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，24 h 后拍照。用Image J 軟件計(jì)算劃痕面積，從而得出細(xì)胞遷移率［9］。細(xì)胞遷移率（%）=實(shí)驗(yàn)組劃痕面積/對(duì)照組劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲

將Transwell小室用0.5%Matrigel基質(zhì)膠50 μL鋪板，置37℃培養(yǎng)箱孵育過夜，而后各孔加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱孵育30 min 水化基底膜，取出后吸出殘余液體，備用。調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×108L-1，取90 μL加入Transwell小室上室中，同時(shí)各孔分別加入終百分比為0.0%，2.5%，5.0%和10.0%CKI 溶液10 μL，細(xì)胞對(duì)照組加入等體積PBS，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。24孔板中每孔加入900 μL 含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將Transwell小室放入其中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，用鑷子輕輕取下濾膜，用5%戊二醛4℃固定10 min，用0.1%甲紫染液于水平搖床上染色30 min，PBS漂洗3次，用棉簽擦掉膜上層未穿過的細(xì)胞，置于載玻片上，100 倍鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)［10］。侵襲率（%）=給藥組細(xì)胞侵襲數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)×100%。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)NF-κB mRNA水平

終百分比為5.0%和10.0%CKI加入SMMC-7221細(xì)胞中孵育12 h 后收集細(xì)胞，Trizol 提取SMMC-7221 細(xì)胞RNA，按說明書操作，以GAPDH 為內(nèi)參基因在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列：NF-κB 正向：5′-GGACCAGCAAAGGTTATTGTTC-3′，反向：5′-TTATACACGCCTCTGTCATTCG-3′；GAPDH正向：5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′，反向：5′-GATGTCTGGAGAGCCCCG-3′。反應(yīng)程序：95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，以循環(huán)閾值（Ct 值）作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，mRNA 的表達(dá)水平采用2-ΔΔCt表示。每組重復(fù)3 次。

1.7 Western印跡法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)水平

SMMC-7221 細(xì)胞以1×108L-1的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入CKI（終百分比為5.0%和10.0%）同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組，處理24 h 后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，并加入SDS 裂解緩沖液于冰上裂解15 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度并配平至濃度體積一致的樣品，上樣量20 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜至0.2 μm PVDF 膜。封閉液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，一抗?jié)舛确謩e為GAPDH（1∶5000）和NF-κB（1∶2000），洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜后用ECL顯影，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值反映目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CKI對(duì)SMMC-7221細(xì)胞存活率的影響

MTT 結(jié)果顯示（圖1），2.5%，5.0%和10.0%CKI 處理后，SMMC-7221 細(xì)胞存活率分別為細(xì)胞對(duì)照組的（92±8）%，（77±5）%和（56±7）%，其中5.0%和10.0%CKI 組細(xì)胞存活率較細(xì)胞對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）。

2.2 CKI對(duì)SMMC-7221細(xì)胞體外遷移能力的影響

劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），經(jīng)2.5%，5.0%和10.0%的CKI 處理24 h 后，SMMC-7221 細(xì)胞遷移率分別為（90±7）%，（50±10）%和（25±5）%，與細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞遷移率（100±8）%相比，5.0%和10.0%CKI 處理組細(xì)胞體外遷移率明顯降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of Compound Kushen Injection（CKI）on proliferation of SMMC-7221 cells by MTT.SMMC-7221 cells were treated with CKI at different dilution percentage for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0.0%CKI（cell control）group.

Fig.2 Effect of CKI on migration of SMMC-7221 cells in vitro by wound healing assay（×100）.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.Cell migration rate（%）=Experimental group wound area/control group wound area×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0.0%CKI group.

Fig.3 Effect of CKI on invasion of SMMC-7221 cells in vitro by transwell chamber assay（Giemsa staining，×100）.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.Invasion rate（%）=Experimental group invasion cell number/control group invasion cell number×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0.0%CKI group.

2.3 CKI對(duì)SMMC-7221細(xì)胞體外侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），SMMC-7221細(xì)胞經(jīng)2.5%，5.0%和10.0%CKI處理24 h后，細(xì)胞侵襲率分別為（98±7）%，（51±10）%和（20±5）%。與細(xì)胞對(duì)照組（100±8）%相比，5.0%和10.0%CKI 組SMMC-7221 細(xì)胞體外侵襲能力顯著降低（P＜0.01）。

2.4 CKI 對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞NF-κB mRNA 水平的影響

RT-PCR 結(jié)果（圖4）表明，5.0%和10.0%CKI處理SMMC-7221細(xì)胞12 h后，細(xì)胞NF-κB mRNA水平分別降低至細(xì)胞對(duì)照組的（42±9）%和（46±10）%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of CKI on levels of NF-κB mRNA in SMMC-7221 cells by RT-PCR.SMMC-7221 cells were treated with CKI for 12 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0.0%CKI group.

2.5 CKI 對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞NF-κB 蛋白表達(dá)的影響

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比，5.0%和10.0%CKI處理組SMMC-7221細(xì)胞NF-κB 蛋白表達(dá)分別降低至（67±16）%和（27±11）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of CKI on levels of NF-κB protein in SMMC-7221 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0.0%CKI group.

3 討論

本研究MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CKI 對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞存活率具有顯著的抑制作用，且隨CKI濃度增高，其對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用增強(qiáng)。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。

肝癌細(xì)胞可發(fā)生血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，而遷移和（或）侵襲是其導(dǎo)致患者死亡和預(yù)后不良的主要因素［11］。本研究中，細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，CKI 顯著抑制SMMC-7221細(xì)胞遷移和侵襲。提示CKI如果用于肝癌患者，可能會(huì)抑制肝癌細(xì)胞的遷移或侵襲。

CKI 中含有多種生物堿，已經(jīng)分離出來的生物堿多達(dá)36 種，其中以苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和槐定堿5種含量為高，本批次CKI中，含苦參堿2.579 g·L-1，氧化苦參堿8.515 g·L-1，槐果堿0.767 g·L-1，氧化槐果堿2.655 g·L-1，槐定堿1.094 g·L-1?？鄥A單體在U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上發(fā)揮抗遷移和侵襲作用所需的濃度是0.1 g·L-1［12］，氧化苦參堿單體在肝癌細(xì)胞上發(fā)揮抗遷移和侵襲作用需要的劑量是1.0 g·L-1［13］。目前研究認(rèn)為，氧化槐果堿、槐果堿和槐定堿具有抑制腫瘤作用，但其是否具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。由于苦參堿和氧化苦參堿能夠在體內(nèi)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，因此推測(cè)，CKI發(fā)揮抑制SMMC-7221細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用是苦參堿和氧化苦參堿的綜合作用。

進(jìn)一步機(jī)制研究表明，CKI 能夠抑制SMMC-7221 細(xì)胞NF-κB mRNA 和蛋白表達(dá)水平。NF-κB是肝癌發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等的重要調(diào)控因子［14-15］。在人類腫瘤尤其是淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中常見NF-κB家族基因突變［16］。

綜上所述，CKI具有明顯的抑制SMMC-7221細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究中體外實(shí)驗(yàn)所用CKI濃度較高，注射至動(dòng)物體內(nèi)后濃度會(huì)相應(yīng)下降，可能難以達(dá)到起效所需的暴露濃度，后續(xù)我們將在荷瘤動(dòng)物模型上進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)的同時(shí)考察其瘤體內(nèi)的暴露。本研究探討了CKI體外抗腫瘤活性，其體內(nèi)抗腫瘤效果是否與體外結(jié)果一致，還有待進(jìn)一步研究。