王朦，賈國(guó)存，成怡冰，王海軍，劉煒，郭亞瓊

急性髓系白血?。ˋML）是一組臨床及生物學(xué)特征均具有異質(zhì)性的惡性疾病，好發(fā)于兒童，占急性白血病的20%～25%［1]。隨著危險(xiǎn)度分層指導(dǎo)個(gè)體化治療的廣泛應(yīng)用，兒童AML的預(yù)后較以往大幅改善，誘導(dǎo)化療總體完全緩解率可達(dá)85%～90%，且5年總生存率已上升至60%～75%［2]。但仍有部分AML患兒誘導(dǎo)化療病情難以緩解或出現(xiàn)復(fù)發(fā)，AML長(zhǎng)期治療仍面臨著高復(fù)發(fā)率、治療相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)、化療相關(guān)毒副作用等多重挑戰(zhàn)［3-4]。青蒿素為我國(guó)學(xué)者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類(lèi)衍生物，為中國(guó)自主研發(fā)的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素類(lèi)抗瘧特效藥。近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)白血病、口腔癌、膀胱癌、宮頸癌等多種疾病均具有較強(qiáng)的抑制作用［5-6]，對(duì)白血病也有高度敏感性，且毒副作用小、易耐受，并與傳統(tǒng)化療藥物不存在交叉耐藥作用［7]，這為研究開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、有效的AML治療藥物提供了新的線(xiàn)索?；诖?，本文擬觀察不同濃度的青蒿琥酯對(duì)AML原代細(xì)胞與細(xì)胞株K562的增殖抑制及促凋亡作用，以期為進(jìn)一步明確AML的發(fā)病機(jī)制及青蒿琥酯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料 AML兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞免疫學(xué)分型確診；（2）初治或復(fù)發(fā)AML；（3）患兒家屬均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情且簽署知情同意書(shū)；（4）臨床診治資料完善。

采用密度梯度法分離2016年10月—2018年10月于河南省兒童醫(yī)院血液科就診的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的24例初治或復(fù)發(fā)AML患兒的骨髓液4～5 ml，加入抗凝離心管（含肝素0.3 ml），取等體積磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將骨髓液稀釋?zhuān)浞只靹颉Ｈ×馨图?xì)胞分離液4～5 ml加入干燥離心管中，再緩慢將稀釋后的骨髓液加入分離液上層，2500 r/min離心20 min（離心半徑為15 cm），取中間單個(gè)核細(xì)胞層，移入干潔離心管中，用PBS漂洗2次，1000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），棄上清液，37 ℃、95%飽和濕度、5% CO2條件下RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 d換液1次。調(diào)整密度為1×106/ml，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞活性＞95%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。入選的24例初治或復(fù)發(fā)AML患兒FAB分型均為M1型，其中男13例，女11例；年齡（7.2±1.6）歲；正常核型AML 8例，異常核型AML 16例。

AML細(xì)胞株K562購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液。

1.2 主要儀器與試劑 5417低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppondoff公司）；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；FACSCaliber流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

注射用青蒿琥酯粉針劑（廣西桂林南藥股份有限公司）；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 藥物配置及實(shí)驗(yàn)分組 無(wú)菌條件下，將青蒿琥酯粉針劑加入所附5% NaHCO3溶液1 ml中，振搖1 min使其充分溶解，注入RPMI 1640培養(yǎng)液5 ml，充分混勻，則青蒿琥酯濃度為10 mg/ml。取上述青蒿琥酯液1 ml加入終體積為10 ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中，充分混勻，則青蒿琥酯濃度為1 mg/ml；參照此方法分別配備3種濃度（12.5、25.0、50.0 μg/ml）的青蒿琥酯液均于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

AML原代細(xì)胞及細(xì)胞株K562均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（依次為對(duì)照組1和實(shí)驗(yàn)組1，對(duì)照組2和實(shí)驗(yàn)組2），其中對(duì)照組1及對(duì)照組2不予青蒿琥酯干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2分別添加終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯液（分別記為終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2）。

本研究?jī)r(jià)值：

（1）當(dāng)前仍有部分急性髓系白血?。ˋML）患兒經(jīng)常規(guī)治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或難以緩解的現(xiàn)象。青蒿素為我國(guó)學(xué)者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類(lèi)衍生物，為中國(guó)自主研發(fā)的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素類(lèi)抗瘧特效藥。但現(xiàn)階段青蒿琥酯對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡作用機(jī)制尚不清楚。

（2）王朦等得出青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，該結(jié)果為青蒿琥酯作為AML治療新的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望推動(dòng)青蒿琥酯的進(jìn)一步研究。

（3）本研究雖然證實(shí)青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細(xì)胞及細(xì)胞株K562的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但其具體機(jī)制仍未闡述，尚需進(jìn)一步研究。

1.4 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562細(xì)胞生存情況 分別吸取干預(yù)前、干預(yù)后24 h、干預(yù)后48 h、干預(yù)后72 h懸浮細(xì)胞10 μl置入干燥塑料離心管，加入0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色液10 μl混勻，染色約1 min，經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞懸液從細(xì)胞計(jì)數(shù)板的一側(cè)緩慢加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，使懸液充滿(mǎn)蓋玻片，靜置3 min。在低倍顯微鏡下（×100）觀察計(jì)數(shù)板細(xì)胞數(shù)。其中呈藍(lán)色染色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，而不染色的細(xì)胞為活細(xì)胞。細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 采用MTT法檢測(cè)AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562生長(zhǎng)抑制情況 各組加入不同濃度青蒿琥酯液后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，一板孵育48 h，一板孵育72 h。每板在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入50 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h，使MTT還原為甲臜，取出96孔板，置于平板離心機(jī)，1000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），棄上清液，每孔加二甲基亞砜150 pl，于微型混合器振蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下測(cè)定吸光度（A）值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-A干預(yù)/A對(duì)照）×100%。

1.6 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562凋亡情況 各組細(xì)胞分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集，取1×106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，然后加入10 μl的AnnexinV緩沖液懸浮細(xì)胞，各管中分別加入5 μl AnnexinV，5 μl 碘化丙啶混勻，避光放置15 min，再加AnnexinV緩沖液500 μl，2000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間細(xì)胞存活率、生長(zhǎng)抑制率、凋亡率比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞存活率比較 對(duì)照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)24 h AML原代細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞存活率低于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)72 h AML原代細(xì)胞存活率低于終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞存活率兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)72 h AML原代細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1）。

表1 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞存活率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of survival rates of primary AML cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

表1 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞存活率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of survival rates of primary AML cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

注：與對(duì)照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組185.74±4.3173.21±3.2073.45±3.35終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組185.60±4.3844.59±5.34a 13.62±1.32a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組184.63±4.3543.62±6.56a 8.06±1.54ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組183.55±3.7939.56±6.88a 6.44±1.69ab F值 0.34844.4491366.590 P值 0.791 ＜0.001 ＜0.001

2.2 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML細(xì)胞株K562存活率比較 對(duì)照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組 2干預(yù) 24 h AML細(xì)胞株K562存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h、72 h AML細(xì)胞株K562存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h、72 h AML細(xì)胞株K562存活率低于對(duì)照組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)72 h AML細(xì)胞株K562存活率低于終濃度12.5μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h AML細(xì)胞株K562存活率兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)72 h AML細(xì)胞株K562存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2）。

表2 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML細(xì)胞株K562存活率比較（±s，%，n=3）Table 2 Survival rate of AML K562 cell line at different intervals in control group 2 and experimental subgroup 2

表2 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML細(xì)胞株K562存活率比較（±s，%，n=3）Table 2 Survival rate of AML K562 cell line at different intervals in control group 2 and experimental subgroup 2

注：與對(duì)照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組286.06±7.2275.87±5.4276.20±5.43終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組285.61±5.3341.56±5.01a 12.56±2.01a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組284.43±4.1137.23±5.30a 7.23±1.30ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組284.70±4.7234.23±5.34a 5.23±1.34ab F值 0.11780.762725.746 P值 0.949 ＜0.001 ＜0.001

2.3 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 對(duì)照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí) 驗(yàn) 亞 組 1干 預(yù) 24 h、48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)24 h、48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表3）。

表3 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 3 Comparison of growth inhibition rates of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

表3 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 3 Comparison of growth inhibition rates of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 at different intervals

注：與對(duì)照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組11.83±0.342.43±0.543.31±0.51終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組114.50±2.97a 16.79±3.27a 19.33±3.80a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組115.36±4.34a 33.32±6.41ab 45.54±8.55ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組116.39±5.40a 34.56±6.22ab 47.96±7.37ab F值 19.70661.33278.049 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 對(duì)照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí) 驗(yàn) 亞組 2干 預(yù) 24 h、48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)24 h、48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于對(duì)照組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h、72 h AML原代細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表4）。

表4 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML細(xì)胞株K562生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 4 Comparison of the inhibition rate of AML K562 cell growth between control group 2 and experimental subgroup 2 at different intervals

表4 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)AML細(xì)胞株K562生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 4 Comparison of the inhibition rate of AML K562 cell growth between control group 2 and experimental subgroup 2 at different intervals

注：與對(duì)照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組22.53±0.574.10±0.885.66±0.86終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組215.63±3.42a 19.40±3.76a 22.15±5.00a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組217.26±5.33a 30.03±7.39ab 43.73±7.79ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組217.30±4.80a 34.87±7.96ab 44.75±8.65ab F值 19.29033.54752.426 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組1及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率高于終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表5）。

表5 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 5 Comparison of apoptotic rate of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 after 48 hours of intervention

表5 對(duì)照組1及實(shí)驗(yàn)組1各亞組干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 5 Comparison of apoptotic rate of AML stem cells in control group 1 and experimental subgroup 1 after 48 hours of intervention

注：與對(duì)照組1比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組1比較，bP＜0.05；AML=急性髓系白血病

組別 AML原代細(xì)胞對(duì)照組13.90±0.87終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組134.78±7.80a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組146.32±8.23ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組147.44±8.12ab F值 50.634 P值 ＜0.001

2.6 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組2及終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中終濃度12.5、25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率高于終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；終濃度25.0、50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2干預(yù)48 h AML原代細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表6）。

表6 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)48 h AML細(xì)胞株K562凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 6 Comparison of apoptotic rate of AML K562 cell in control group 2 and experimental subgroup 2 after 48 h of intervention

表6 對(duì)照組2及實(shí)驗(yàn)組2各亞組干預(yù)48 h AML細(xì)胞株K562凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 6 Comparison of apoptotic rate of AML K562 cell in control group 2 and experimental subgroup 2 after 48 h of intervention

注：與對(duì)照組2比較，aP＜0.05；與終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組2比較，bP＜0.05

組別 AML細(xì)胞株K562對(duì)照組22.97±0.66終濃度12.5 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組236.82±7.17a終濃度25.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組247.56±8.29ab終濃度50.0 μg/ml實(shí)驗(yàn)亞組247.43±7.92ab F值 58.253 P值 ＜0.001

3 討論

針對(duì)白細(xì)胞增殖、分化和凋亡的不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，臨床已相應(yīng)研究不同作用途徑的抗白血病藥物，化學(xué)合成的抗白血病藥物雖然療效確切，但毒副作用明顯，易產(chǎn)生多藥耐藥性，使許多患者不能耐受，尤其對(duì)兒童白血病，耐受性限制了諸多藥物的使用。從祖國(guó)龐大的中藥寶庫(kù)中尋找、開(kāi)發(fā)高效、低毒的抗白血病制劑有重大臨床意義。既往研究顯示，雷公藤、青黛、大蒜素、蟾酥、葛根等眾多中藥成分均有不同程度抗白血病作用［8-10]。青蒿素作為我國(guó)學(xué)者首次從菊科植物黃花蒿中提取的化合物，青蒿琥酯為青蒿素類(lèi)衍生物，為中國(guó)自主研發(fā)的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素類(lèi)抗瘧特效藥，對(duì)耐藥的腫瘤細(xì)胞也有效，且毒副作用小、患者易耐受［11-13]。對(duì)于白血病而言，早期陳偉等［14]、彭宇等［15]研究證實(shí)青蒿素及其衍生物對(duì)HL60白血病細(xì)胞有體外抑制作用，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用突出；孫艷美等［16]的研究顯示，與空白對(duì)照組比較，青蒿琥酯50、100 μmol/L處理AML細(xì)胞株K56248 h后S期細(xì)胞減少，G2期、M期細(xì)胞增加；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加后，G2M期細(xì)胞減少，但死亡細(xì)胞增加到39.65%，且青蒿琥酯可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)明顯增加，由此認(rèn)為青蒿琥酯可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用，并可能對(duì)白血病具有高度敏感性。

本研究主要觀察青蒿素類(lèi)衍生物青蒿琥酯對(duì)AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562增殖和凋亡的影響，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，作為對(duì)照的AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562在干預(yù)48、72 h細(xì)胞存活率仍在70%以上，而加入不同濃度青蒿琥酯進(jìn)行干預(yù)的組別干預(yù)48 h的細(xì)胞存活率均降至50%以下，且明顯低于對(duì)照；青蒿琥酯終濃度為25.0 μg/ml、50.0 μg/ml的實(shí)驗(yàn)組干預(yù)72 h后細(xì)胞大量死亡，存活率不足10%，明顯低于青蒿琥酯終濃度為12.5 μg/ml的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。同時(shí)，采用MTT法檢測(cè)終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯對(duì)AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562作用不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，對(duì)AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562的增殖抑制最適的青蒿琥酯濃度為25.0 μg/ml，表明青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細(xì)胞及細(xì)胞株K562的增殖，且與濃度和/或時(shí)間均有關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)了抑制細(xì)胞增殖是青蒿琥酯抗白血病的主要機(jī)制之一。此外，本研究各實(shí)驗(yàn)組不同濃度青蒿琥酯作用48 h后，AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562細(xì)胞凋亡率明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組，其中終濃度為25.0、50.0μg/ml的青蒿琥酯干預(yù)后AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562細(xì)胞凋亡率明顯高于12.5 μg/ml，這一點(diǎn)與張萍等［17]結(jié)果類(lèi)似，表明青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)AML原代細(xì)胞及細(xì)胞株K562凋亡。李異興等［18]認(rèn)為青蒿琥酯主要通過(guò)降低線(xiàn)粒體跨膜電位促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡物質(zhì)的釋放及caspase的激活來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。歐瑞明等［19]認(rèn)為青蒿琥酯可以通過(guò)抑制NF-κB通路或抑制Bcl-2/bax的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但青蒿琥酯抑制AML原代細(xì)胞及細(xì)胞株K562的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，青蒿琥酯能夠有效抑制AML原代細(xì)胞、細(xì)胞株K562的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，該結(jié)果為青蒿琥酯作為AML治療新的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望推動(dòng)青蒿琥酯的進(jìn)一步研究，為AML的靶向治療奠定基石。