朱 波 楊 艷 蘇仁意 許細(xì)平 孫乾朕 闕新祥

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000；2.長(zhǎng)江大學(xué)仙桃臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 仙桃 433000）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)展的終末期表現(xiàn)，其發(fā)生過(guò)程有各種因素參與，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，預(yù)后較差，對(duì)人們生命健康造成了嚴(yán)重的威脅［1-2］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，益氣活血方藥具有益氣活血、溫陽(yáng)利水的作用，而且能改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌能量代謝，增強(qiáng)心肌收縮力和改善心功能［3-4］。心肌線粒體肌酸激酶（mi-CK）是磷酸肌酸激酶（CK）同工酶家族成員，與三磷酸腺苷（ATP）再生有關(guān)。三磷酸肌醇受體（IP3R）能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要的伴侶蛋白Sigma-1受體（Sigma-1R）相互作用從而調(diào)控心血管系統(tǒng)功能。為此，本研究建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，探討該方抗心力衰竭的機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康Wistar大鼠90只，雄性，12周齡，體質(zhì)量（210±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0001，1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 益氣活血復(fù)方提取浸膏干粉（黃芪、丹參、人參、益母草、三七粉、茯苓、葶藶子，此組方每克干粉相當(dāng)于生藥2.86 g），襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院提供。賴諾普利片由國(guó)藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司生產(chǎn)，每片5 mg；國(guó)藥準(zhǔn)字：H20065767。

1.3 試劑及儀器 mi-CK免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；羊抗兔IgG、mi-CK抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；基因擴(kuò)增儀Gene Amp PCR system 9700（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；SONOS5500彩色多普勒超聲機(jī)（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BS-51顯微鏡（日本Olympus公司）。引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 模型制備 采用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.5～0.8 mL/100 g），大鼠背位固定，經(jīng)喉氣管插管術(shù)，連接呼吸機(jī)，以50～55次/min，潮氣量0.7～0.8 mL進(jìn)行人工呼吸。在左胸第3～4肋間橫向切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)度大概1.5 cm，鈍性分離肌層，接著沿3～4肋間隙打開(kāi)胸腔，暴露心臟，撕開(kāi)心包，輕提左心耳，在動(dòng)脈左主干起源點(diǎn)2～4 mm處用6號(hào)縫線結(jié)扎（正常組只穿線，不結(jié)扎），隨后立即重置心臟于胸腔，逐層縫合。術(shù)后連續(xù)7 d注射青霉素鈉，預(yù)防感染，常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后第5周行EF檢測(cè)，心電圖顯示左室射血分?jǐn)?shù)EF值≤40%則表示心衰造模成功。

1.5 分組與給藥 剔除死亡以及不符合心衰標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥組，未左冠脈結(jié)扎手術(shù)只穿線的假手術(shù)大鼠納入正常組。每組各15只大鼠。術(shù)后第5周正常組及模型組灌服等容積蒸餾水，每日1次。根據(jù)換算公式，給藥劑量（g/kg）=人的劑量（g）×0.018/所求動(dòng)物體質(zhì)量（kg）。中藥組予以4.6 g生藥量（kg·d）的益氣活血方藥物；西藥組予以1.5 mg生藥（kg·d）的賴諾普利片，各組連續(xù)給藥4周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。將連續(xù)給藥（蒸餾水）結(jié)束后的大鼠，以10%水合氯醛0.5～0.8 mL/100 g腹腔麻醉，背位固定于鼠板，應(yīng)用心臟Doppler檢測(cè)左室壓力變化最大速率（±dp/dtmax）。2）心肌組織IP3R mRNA、mi-CK mRNA的檢測(cè)。處死大鼠，取心臟心肌組織，分成2份，裝入凍存管，并于液氮中冷凍后，-80℃冰箱保存，待測(cè)。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測(cè)IP3R mRNA、mi-CK mRNA表達(dá)：取出標(biāo)本后，用Trizol法提取總RNA，計(jì)算總RNA的濃度和純度。取2 μg總RNA，按照說(shuō)明書(shū)配制20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增IP3R、mi-CK，并擴(kuò)增β-actin。以cDNA為模板，擴(kuò)增出208 bp的DNA序列。IP3R的序列如下。上游引物：5′CATTTGCCGACTCTGCTACA3′。下游引物：5′TGTGCTTTTCCAGGAGCT TT3′。mi-CK的序列：上游引物：5′AGATGCCAGTAA AATCCGTTCTG3′。下游引物：5′TTCGGCCAGTTCTGACTCTAGAG3′。內(nèi)參對(duì)照物β-actin的序列：上游引物：5′AGATCCTGACCGAGCGTGGC3′。下游引物：5′CCAGGGAGGAAGAGGATGCG3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃10 min預(yù)變性，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。灌制瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組左室壓力變化最大速率比較 見(jiàn)表1。本次研究結(jié)果中，與正常組比較，各治療組±dp/dtmax明顯升高，模型組明顯下降（P＜0.05）；與各治療組比較，模型組±dp/dtmax明顯下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組±dp/dtmax明顯升高（P＜0.05）。

圖1 IP3R、mi-CK、β-actin擴(kuò)增片段電泳圖

2.2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較 見(jiàn)表2。如表2所示，與正常組比較，中藥組和模型組IP3RmRNA表達(dá)明顯增加，模型組mi-CK mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），正常組與西藥組在IP3R mRNA、mi-CK mRNA表達(dá)上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與各治療組比較，模型組IP3R mRNA表達(dá)明顯增加，mi-CK mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組IP3R mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；西藥組mi-CK mRNA表達(dá)高于中藥組，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組左室壓力變化最大速率比較（mmHg/s，±s）

表1 各組左室壓力變化最大速率比較（mmHg/s，±s）

與正常組比較，?P＜0.05；與各治療組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，#P＜0.05。下同

-dp/dtmax 4908.63±100.71*#4716.41±109.24*5024.11±108.723101.54±116.18△組別中藥組西藥組正常組模型組n 15151515+dp/dtmax 5643.19±195.13*#5212.67±171.07*4816.63±160.323256.22±180.54*△

表2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較（2-△△Ct，±s）

表2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較（2-△△Ct，±s）

組別n IP3R mRNA mi-CK mRNA 15151515中藥組西藥組正常組模型組1.15±0.13*#1.03±0.071.02±0.141.52±0.47*△1.69±0.991.71±0.781.90±0.981.29±0.69*△

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用冠脈結(jié)扎法制備心衰大鼠模型，模擬臨床上較為常見(jiàn)的缺血性心衰，是目前成熟且公認(rèn)的心衰模型，與心肌梗死所致的心力衰竭的病理生理變化相似。并且針對(duì)氣虛血瘀這一病機(jī)，選用中藥益氣活血復(fù)方灌胃，方中黃芪可補(bǔ)氣固表，托毒排膿；丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛的作用；人參有補(bǔ)脾益肺、生津之功效；益母草可活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒；三七粉止血、散瘀；茯苓健脾、寧心；葶藶子具有利水消腫、泄熱逐邪的作用，諸藥共奏益氣活血、通絡(luò)化瘀之效［5-6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血方藥能夠抑制或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，緩解心力衰竭。本研究結(jié)果顯示，模型組±dp/dtmax明顯低于正常組，說(shuō)明模型組大鼠心功能下降，符合心衰癥狀。經(jīng)治療，各藥物組±dp/dtmax明顯高于模型組，提示應(yīng)用藥物后，西藥及益氣活血中藥都能夠延緩心功能轉(zhuǎn)向失代償期的進(jìn)程，減輕心功能惡化。與西藥組比較，中藥組±dp/dtmax明顯升高，提示益氣活血方具有增強(qiáng)心肌收縮力的作用。

心臟主要由大量的ATP維持收縮功能以及磷酸肌酸（PCr）儲(chǔ)備能量［7-8］。然而ATP本身含量相對(duì)少，CK作為肌酸激酶能量穿梭系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，其穿梭系統(tǒng)調(diào)控ATP與PCr間的能量轉(zhuǎn)換［9-10］。當(dāng)發(fā)生CHF，會(huì)損傷肌酸激酶穿梭系統(tǒng)功能，mi-CK與CK受抑，影響ATP轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭效率，進(jìn)而使得心肌收縮功能障礙。本研究結(jié)果顯示，模型組心衰大鼠心肌mi-CK mRNA明顯低于正常組。經(jīng)治療，各用藥組大鼠mi-CK mRNA及蛋白有所上升，且明顯高于模型組，但西藥組與中藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明中西醫(yī)治療均可以上調(diào)mi-CK mRNA水平，改善ATP轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭效率，增加細(xì)胞內(nèi)能量流，增強(qiáng)心肌收縮力，減緩心衰惡化的進(jìn)程。

相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為，IP3R與Sigma-1R相互作用會(huì)對(duì)Ca2+-ATP酶活性造成間接影響［11-13］。在Sigma-1R抑制劑的作用下，會(huì)削弱Sigma-1R與IP3R形成復(fù)合體，抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，而且誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放至胞質(zhì)，以至于減少線粒體ATP，造成心功能惡化［14-15］。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，中藥組和模型組IP3R mRNA表達(dá)明顯增加；與各治療組比較，模型組mi-CK mRNA表達(dá)下降，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與西藥組比較，中藥組IP3R mRNA表達(dá)明顯增加，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說(shuō)明益氣活血方可能通過(guò)抑制IP3R mRNA，進(jìn)一步調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體間Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善亞細(xì)胞器損傷，改善心肌能量代謝?？紤]到亞細(xì)胞器間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，關(guān)于IP3R在保護(hù)心肌細(xì)胞上的作用仍需進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，為治療CHF提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，益氣活血復(fù)方可降低心衰大鼠心肌IP3R mRNA表達(dá)，增加mi-CK mRNA表達(dá)，改善亞細(xì)胞器損傷和ATP轉(zhuǎn)運(yùn)穿梭效率，改善心肌的舒縮功能，減緩心衰惡化的進(jìn)程。