郭丹丹 于思明 張鴻婷 趙海燕

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

流行病學(xué)研究表明，在55歲以上的中國(guó)人中，近1.3%的人出現(xiàn)了各種心衰癥狀［1］。大多數(shù)心衰患者表現(xiàn)為心肌功能減退和血流不足，導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)能力下降［2］。在東方國(guó)家（如中國(guó)、韓國(guó)和日本），許多人更喜歡使用草藥治療心血管疾?。?］。燧心膠囊是一種中藥復(fù)方制劑，可以提高左室射血分?jǐn)?shù)，改善心力衰竭患者的臨床癥狀［4］。然而，這種心臟保護(hù)作用的確切分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）釋放通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存分子結(jié)構(gòu)的闡明有助于我們深入了解健康和受損心臟的Ca2+穩(wěn)態(tài)和鈣釋放-收縮耦合相關(guān)機(jī)制［5］。有報(bào)道稱，肌漿網(wǎng)Ca2+的異常釋放可能導(dǎo)致心衰患者的收縮功能障礙和心律失常［6］。心衰患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣含量的降低可能是由于肌漿網(wǎng)鈣泵（肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶，SERCA）對(duì)肌漿網(wǎng)攝取和儲(chǔ)存Ca2+的抑制減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞除極化時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度降低，使心肌舒縮功能減弱［7］?；诖?，本研究探討心肌梗死后心衰大鼠心功能的影響，檢測(cè)SERCA基因表達(dá)水平，以期從分子水平闡明燧心膠囊改善心功能的可能藥理作用機(jī)制，為燧心膠囊的臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～240 g，6周齡，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SCXK（黑）2018-0018。對(duì)動(dòng)物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。燧心膠囊（由制附子、紅參、丹參、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院制劑室制備，去掉膠囊皮，用蒸餾水溶解后制成生藥含量0.27、0.54、1.08 g/mL的備用液）；卡托普利（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，用蒸餾水溶解后制成、1.0 mg/mL的備用液）；水合氯醛（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；TRIzol（天根生化科技有限公司）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司）；熒光定量PCR試劑盒（大連 TaKaRa公司）；SERCA、受磷蛋白（PLB）和GADPH引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成：SERCA上游引物為 5′-TCTGACTTTCGTTGGCTGTG-3′，下游引物為5′-GCCTTTGTTATCCCCAGTG-3′；PLB上游引物為 5′-CTTTTGTCTTCCTGGCATCA-3′，下游引物為5′-AGGTTCTGGAGGTTCTGACG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物為5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物為：5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。2）儀器。VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；BL-410生物檢測(cè)系統(tǒng)（成都泰盟公司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 分組與造模 隨機(jī)選擇80只大鼠進(jìn)行心肌梗死后心衰模型制備，剩余大鼠作為假手術(shù)組。大鼠術(shù)前12 h禁食，用10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）麻醉后進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)予以正壓通氣，在左側(cè)第4肋開胸，分離心包膜，暴露心臟，采用左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎產(chǎn)生心肌梗死，結(jié)扎后心室顏色變暗，同時(shí)心電圖顯示ST段抬高，則認(rèn)為該急性心肌梗死模型是成功的，術(shù)后關(guān)腹縫合。假手術(shù)組接受同樣的手術(shù)，但不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。4周后以多普勒超聲顯示左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤45%為心衰模型成功標(biāo)志［8］。有43大鼠造模成功，將造模成功大鼠分為模型對(duì)照組（8只）、卡托普利組（8只）；燧心膠囊低劑量組（9只）、燧心膠囊中劑量組（9只）和燧心膠囊高劑量組（9只）。燧心膠囊低、中、高劑量組依次灌胃給予2.7、5.4、10.8 g/kg的燧心膠囊，卡托普利組給予5.83 mg/kg卡托普利，每日1次，連續(xù)8周。假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）心功能檢測(cè)。末次給藥1 h后，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，采用VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀分別測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS），取3個(gè)心動(dòng)周期求平均值。2）血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。做完心功能檢測(cè)后，分離右頸外動(dòng)脈，穿刺插入PE50小鞘管，與BL-410生物檢測(cè)系統(tǒng)連接，將鞘管送入左心室，記錄左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。3）RT-PCR法檢測(cè)SERCA和PLB mRNA表達(dá)。心功能血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)合后處死大鼠，取約0.1 g左心室組織，用液氮充分研磨后加入1 mL TRIzol進(jìn)行總RNA提取，然后合成cDNA，制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。以GADPH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SERCA和PLB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBMSPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明模型組大鼠泵血功能下降，造模成功。與模型組比較，卡托普利組和各燧心膠囊治療組大鼠LVESD和LVEDD降低，LVEF和LVFS增高，各燧心膠囊治療組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS隨藥物劑量增加而變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVSP和LVEDP升高，+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，卡托普利組和各燧心膠囊治療組大鼠LVSP和LVEDP降低，+dp/dtmax和-dp/dtmax升高，各燧心膠囊治療組大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax隨藥物劑量增加而變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05；與卡托普利組比較，&P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 108 8 9 9 9 LVESD（mm）3.94±0.426.51±0.43#4.62±0.39#*5.97±0.24#*&5.64±0.47#*&4.77±0.35#*LVEDD（mm）5.68±0.368.39±0.54#6.21±0.57#*7.64±0.40#*&7.25±0.81#*&6.43±0.58#*LVEF（%）78.06±8.6240.28±5.43#66.49±7.18#*47.81±9.22#&53.48±7.03#*&59.01±4.52#*LVFS（%）40.95±5.6320.35±4.01#34.45±6.79#*20.17±3.53#&29.12±4.00#*&31.08±5.01#*&

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 108 8 9 9 9 LVSP（mmHg）125.37±18.12192.10±20.49#142.25±17.01#*171.04±21.55#&135.36±18.11#*&109.32±21.08#*LVEDP（mmHg）7.68±0.5218.20±1.94#11.21±2.13#*15.02±1.07#&13.23±1.81#&10.43±2.14#*+dp/dtmax（mmHg/s）5453.06±416.142054.18±227.34#3249.84±315.76#*2122.58±207.65#&2448.38±184.57#&3204.05±286.52#*-dp/dtmax（mmHg/s）5545.97±199.341886.64±148.28#3482.15±346.05#*2024.61±159.56#&2584.26±248.36#*&3161.22±260.28#*&

2.3 各組大鼠心肌組織中SERCA和PLB mRNA表達(dá)水平的比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中SERCA mRNA表達(dá)降低，PLB mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，卡托普利組和各燧心膠囊治療組大鼠心肌組織中SERCA mRNA表達(dá)升高，PLB mRNA表達(dá)降低，各燧心膠囊治療組大鼠心肌組織中SERCA和PLB mRNA表達(dá)水平隨藥物劑量增加而變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA和PLB mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織中SERCA和PLB mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組燧心膠囊低劑量組燧心膠囊中劑量組燧心膠囊高劑量組n 1088999 SERCA mRNA 1.00±0.050.51±0.03#0.84±0.04#*0.64±0.07#*&0.71±0.03#*&0.77±0.08#*PLB mRNA 1.00±0.033.81±0.25#1.54±0.19#*2.85±0.27#*&2.41±0.16#*&1.94±0.22#*&

3 討論

在本研究中，我們利用左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠心衰模型證明，燧心膠囊治療可以改善心衰大鼠的心功能，降低LVESD、LVEDD、LVSP和LVEDP，增高LVEF、LVFS、+dp/dtmax和-dp/dtmax。這些效應(yīng)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利所產(chǎn)生的效應(yīng)類似，提示燧心膠囊可以用于心衰的治療［9］。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，心衰大鼠心肌細(xì)胞中SERCA mRNA表達(dá)降低，而SERCA對(duì)維持心臟收縮和舒張功能具有重要意義［10］。因此，本研究從分子水平探討燧心膠囊治療心衰的作用機(jī)制。

心肌收縮力降低是心衰的一個(gè)顯著特征，而心肌收縮力不足的大部分原因是心肌細(xì)胞Ca2+瞬變。肌漿網(wǎng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度中起關(guān)鍵作用［11］。SERCA將Ca2+從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到肌漿網(wǎng)中，從而決定了興奮-收縮耦合所需的Ca2+濃度［12］。本研究觀察到心衰大鼠LVESD和LVEDD顯著升高，伴有SERCA活性降低。鈉鈣交換器的上調(diào)和SERCA活性的降低可能是心衰中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+含量降低的原因［13］。因此，SERCA活性降低可能是心衰大鼠左室功能障礙的部分原因。我們的研究表明，燧心膠囊增加SERCA的活性，改善細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)。

PLB是一種SERCA抑制蛋白，是SERCA的主要調(diào)節(jié)劑，主要存在于心室，在心房中存在較少［14］。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性心衰患者中，SERCA和PLB的含量有顯著的變化［15］。在非磷酸化狀態(tài)下，PLB能抑制SERCA對(duì)Ca2+的攝取。當(dāng)PLB發(fā)生磷酸化時(shí)，可以減輕對(duì)SERCA的抑制作用，從而增加Ca2+進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［16］。因此，PLB在心臟的興奮-收縮耦合中起著生理制動(dòng)的作用，從而調(diào)節(jié)心臟的功能。PLB的表達(dá)水平?jīng)Q定了心臟舒張和收縮，PLB的活性減低與SERCA對(duì)Ca2+親和力的增加有關(guān)，SERCA對(duì)Ca2+親和力的增加促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取和抑制Ca2+釋放［17］。目前的研究結(jié)果表明，通過(guò)燧心膠囊治療，心衰大鼠PLB mRNA水平降低，SERCA mRNA水平升高，表明燧心膠囊有助于心臟保護(hù)作用。但本研究沒有對(duì)PLB和SERCA蛋白水平的檢測(cè)，我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)行完善。

本研究以卡托普利作為陽(yáng)性對(duì)照，其能通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）顯著改善心臟功能和增加SERCA活性［18］。ACE可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度活化，減輕心臟負(fù)荷，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心肌功能，保護(hù)心肌細(xì)胞。抑制ACE的藥物還可以增加SERCA活性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)［19］。這些效應(yīng)不僅通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放作用，還有利于心肌松弛，增強(qiáng)心肌收縮力。本研究提示，燧心膠囊對(duì)心衰大鼠的心功能增加和調(diào)節(jié)SERCA的作用與卡托普利相當(dāng)。

綜上所述，燧心膠囊可以增強(qiáng)心衰大鼠射血能力，改善心功能，可能與燧心膠囊使心衰大鼠心肌細(xì)胞中SERCA基因的表達(dá)增加有關(guān)，為燧心膠囊治療心衰提供了理論依據(jù)。