劉曉芳 金昌鳳 魏一強(qiáng) 趙 靜 孫素芹 高 磊 李義君

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150000）

惡性胸腔積液（MPE）約占全部胸腔積液的38%～53%，其中約40%MPE是由肺癌、淋巴癌、乳腺癌等惡性腫瘤胸膜轉(zhuǎn)移引起，是腫瘤擴(kuò)散或病情進(jìn)展至晚期的常見并發(fā)癥之一，臨床MPE的發(fā)生往往預(yù)示預(yù)后不良［1-2］。大量胸腔積液可造成患者胸悶、胸痛、呼吸困難、氣促等癥狀，嚴(yán)重者可危及生命，因此積極有效地控制MPE對(duì)改善腫瘤患者臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期十分重要。目前，MPE治療方法較多，但采用手術(shù)等方法會(huì)引起晚期及老年患者不能耐受，且短期內(nèi)復(fù)發(fā)率仍然很高，同時(shí)化療藥物毒副作用也較大［3-4］。中醫(yī)藥可通過作用于MPE形成的多個(gè)環(huán)節(jié)抑制MPE形成，具有一定安全性和治療療效，是近年來臨床治療惡性腫瘤并發(fā)癥的手段之一［5］。中藥逐水飲由黨參、黃芪、白術(shù)、葶藶子等藥物組成，具有瀉肺利水、消除積液、益氣健脾等作用。本研究體外建立小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型，觀察中藥逐水飲對(duì)小鼠MPE生成及Th17細(xì)胞免疫平衡的影響，探討其治療MPE的可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠，70只，SPF級(jí)，12周齡，體質(zhì)量15～25 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（黑）20160013。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：中藥逐水飲，組成：黃芪20 g，人參15 g，葶藶子20 g，瓜蔞皮20 g，大棗15 g，桑白皮15 g，百部15 g，苦參20 g，莪術(shù)15 g，白花蛇舌草20 g，夏枯草10 g，甘草15 g。水煎煮2次，濃縮配制為生藥含量1g/mL藥液。小鼠Lewis肺癌瘤株，上海研生實(shí)業(yè)有限公司提供。胎牛血清，HyClone公司，批號(hào)20170619；生藥含量1 g/mL DMEM培養(yǎng)基，HyClone公司，批號(hào)20170619；RPMI1640培養(yǎng)基，上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)20170725；臺(tái)盼藍(lán)染色液，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)C0040；順鉑注射液，規(guī)格：每支10 mg，齊魯制藥有限公司，批號(hào)20160309；FIcoll分離液，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20170309；枸櫞酸鈉，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)080560059；佛波酯，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P6741；離子霉素，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)I-0634；FITC標(biāo)記的CD4抗體（批號(hào)20170503）、PE標(biāo)記的RORγτ抗體（T17）（批號(hào)20170416）、Alexa647標(biāo)記的Foxp3抗體（Treg）（批號(hào)20170328）購于北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素17（IL-17）（批號(hào)ab83708）、白細(xì)胞介素23（IL-23）（批號(hào)ab23305）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）（批號(hào)ab86349）試劑盒購于Abcam公司。2）儀器：HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海析達(dá)儀器有限公司；RCO3000TVBA CO2培養(yǎng)箱，REVCO公司；DYS-107三目生物顯微鏡，上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司；MS-TS精密天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.3 細(xì)胞傳代及Lewis肺癌單細(xì)胞懸液制備 取小鼠Lewis肺癌瘤株，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，輕輕吸打使細(xì)胞均勻分散，800 r/min離心5 min，棄上清，加入適量含有10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，重懸，制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液加入250 mL培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代，3～4 d傳代1次。取第3代細(xì)胞，接種于小鼠腋背部皮下。取接種10～14 d的小鼠，處死，剝離腫瘤組織，取生長(zhǎng)良好的瘤組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后，用無菌玻璃杵子將瘤塊碾碎成單細(xì)胞懸液，經(jīng)150目篩網(wǎng)過濾后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1500 r/min離心5 min，棄上清，使用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次。加入0.9%氯化鈉溶液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活性細(xì)胞＞90%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。

1.4 動(dòng)物分組及小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型建立70只小鼠去除胸前毛發(fā)，75%乙醇常規(guī)消毒，隨機(jī)選取56只小鼠經(jīng)胸前皮下短時(shí)間內(nèi)注射0.2 mL上述細(xì)胞懸液建立Lewis肺癌胸腔積液模型，給藥1次［6］。造模成功后，隨機(jī)分為模型組、逐水飲組、順鉑組、逐水飲+順鉑組，每組14只。另取14只小鼠皮下短時(shí)間內(nèi)注射0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液作為正常對(duì)照，給藥1次。

1.5 干預(yù)方法 正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不做任何處理。Lewis肺癌胸腔積液模型小鼠建模后第3日起開始給藥。模型組正常喂養(yǎng)，不給予任何藥物。逐水飲組：參考范一平等方法［7］，將27 g/（kg·d）生藥藥液調(diào)整至0.2 mL給予小鼠灌胃，每日1次。順鉑組：將順鉑注射液用9 L 0.9%氯化鈉注射液稀釋后，以6 mg/（kg·d）胸腔灌注，隔3日1次。逐水飲+順鉑組：27 g/（kg·d）生藥藥液，調(diào)整至0.2 mL給予小鼠灌胃，每日1次，同時(shí)給予胸腔灌注順鉑6 mg/（kg·d），隔3日1次。各組連續(xù)給藥10 d。

1.6 樣本采集 于建模后第14日行胸部CT檢查，觀察胸腔積液生成情況。給藥結(jié)束后（即建模后第14日），每組取8只小鼠處死。眼球取血，一部分1 mL血樣，經(jīng)2000 r/min離心后收集血清-80℃保存；另一部分1 mL血樣，以體積比1∶1加入PBS溶液稀釋，使用FIcoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。同時(shí)收集MPE，測(cè)量MPE體積。取適量MPE，離心后，棄上清，加入PBS溶液重懸，使用FIcoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞；另取適量MPE，以體積比9∶1加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝，離心取上清保存。每組剩余6只小鼠用于觀察生存率。

1.7 觀察項(xiàng)目 1）胸壁轉(zhuǎn)移瘤計(jì)數(shù)、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量：由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)前、側(cè)、后胸壁轉(zhuǎn)移瘤個(gè)數(shù)，然后剝離胸壁轉(zhuǎn)移瘤，稱質(zhì)量。2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MPE及外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比：離心收集MPE單個(gè)核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，分別加入2 μL佛波酯和伊屋諾霉素混合液、1 μL離子霉素混勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取200 μL細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的RORγτ抗體（Th17）、Alexa647標(biāo)記的Foxp3抗體（Treg）及其相應(yīng)同型抗體，4℃避光染色30 min。使用含2%胎牛血清的PBS溶液洗滌1次，然后加入200 μL PBS溶液重懸，并轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司）檢測(cè)各種熒光素強(qiáng)度，F(xiàn)low-Jo7.6.5軟件分析Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。3）MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子水平：取血清和MPE上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血樣和MPE中IL-17、IL-23、TGF-β1表達(dá)水平。操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胸腔解剖及CT檢查結(jié)果 見圖1，圖2。建模后第14日，各組小鼠行胸部CT檢查，結(jié)果正常對(duì)照組小鼠肺野清晰，胸膜光整，而模型組可見大量胸腔積液生成，順鉑組、逐水飲組和逐水飲+順鉑組胸腔積液減少（見圖1）。處死小鼠，剖開胸骨，暴露胸壁，正常對(duì)照組小鼠可觀察到雙肺色白，胸壁光滑，而模型組小鼠明顯可見血性胸腔積液（見圖2，白色箭頭所示為血性胸腔積液）。

圖1 各組小鼠胸部CT掃描圖

圖2 小鼠胸腔解剖圖

2.2 各組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量及生存期比較 見表1。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積減?。≒＜0.05），胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少（P＜0.05），轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量減輕（P＜0.05），生存期延長(zhǎng)（P＜0.05）；逐水飲組和順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和生存期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與逐水飲組和順鉑組比較，逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和生存期變化更加明顯（P＜0.05）。

表1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量及生存期比較（±s）

表1 各組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量及生存期比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05；與逐水飲組比較，△P＜0.05；與順鉑組比較，▲P＜0.05

組別模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 MPE體積（μL）683.95±57.52314.67±41.17*346.82±48.39*265.83±30.42*△▲胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)（個(gè)）8.91±0.766.24±0.58*5.66±0.61*4.17±0.38*△▲轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量（mg）778.65±82.34513.71±62.79*446.91±71.24*311.24±47.28*△▲生存期（d）18.27±2.1921.22±1.94*21.06±2.03*23.59±1.37*△▲

2.3 各組MPE及外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比比較 見圖3～圖4，表2。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細(xì)胞百分比升高（P＜0.05），MPE中Treg細(xì)胞百分比降低（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細(xì)胞百分比高于順鉑組（P＜0.05），Treg細(xì)胞百分比低于順鉑組（P＜0.05）；逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比與逐水飲組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組小鼠MPE中Th17、Treg細(xì)胞百分比均高于其外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠MPE中Th17、Treg細(xì)胞比例流式圖

圖4 各組小鼠外周血中Th17、Treg細(xì)胞比例流式圖

表2 各組小鼠MPE及外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比比較（±s）

表2 各組小鼠MPE及外周血中Th17、Treg細(xì)胞百分比比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與順鉑組比較，#P＜0.05；與本組外周血比較，▲P＜0.05。下同。

組別正常對(duì)照組模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 8 Th17 MPE—0.72±0.11▲1.24±0.26△#▲0.88±0.15△▲1.37±0.19△#▲外周血0.97±0.150.51±0.09*0.75±0.17△#0.65±0.11△0.86±0.20△#Treg MPE—14.01±3.147.12±2.05△#▲10.52±2.33△▲6.83±1.74△#▲外周血1.51±0.392.87±0.93*1.74±0.52△#2.58±0.71△1.66±0.47△#

2.4 各組MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達(dá)水平比較 見表3。與正常對(duì)照組比較，模型組外周血中IL-17、IL-23水平降低（P＜0.05），TGF-β1水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23水平升高（P＜0.05），TGF-β1水平降低（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23水平高于順鉑組（P＜0.05），TGF-β1水平低于順鉑組（P＜0.05）；逐水飲組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別正常對(duì)照組模型組逐水飲組順鉑組逐水飲+順鉑組n 8 8 8 8 8 IL-17 MPE—18.53±2.5727.64±1.85△#23.37±2.14△28.69±1.91△#外周血23.91±2.1214.17±1.76*20.52±2.01△#17.43±1.58△21.72±1.83△#IL-23 MPE—11.54±2.6219.38±2.15△#16.57±1.73△20.11±2.05△#外周血16.53±1.948.39±1.44*13.52±1.86△#10.75±1.51△14.18±2.11△#TGF-β1 MPE—36.38±2.1912.75±1.96△#15.23±2.05△11.18±1.54△#外周血8.44±1.1530.42±2.51*10.33±1.62△#12.54±1.71△9.88±1.47△#

3 討 論

MPE為胸膜直接受累或肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、消化系統(tǒng)惡性腫瘤等轉(zhuǎn)移至胸膜而引起胸膜腔液生成過快和（或）吸收減慢，導(dǎo)致液體積聚于胸膜腔［8］。約有5%～10%的MPE找不到原發(fā)腫瘤灶，一旦出現(xiàn)則預(yù)后不良，中位生存期僅為4個(gè)月［9-10］。中醫(yī)藥治療MPE，可通過趨化免疫炎性細(xì)胞、調(diào)節(jié)整體免疫功能、抑制化學(xué)性胸膜炎形成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤、抑制MPE形成，療效確切、作用溫和、毒副作用小，為腫瘤晚期及年老體弱患者的MPE治療提供了更多選擇［11］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，MPE歸屬“懸飲”“支飲”范疇，津液失布，邪流胸脅，阻滯三焦，水飲積結(jié)，發(fā)為胸腔積液，以行氣利水、化瘀散結(jié)兼顧護(hù)正氣為主要療法［12］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少，轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量減輕，生存期延長(zhǎng)，說明逐水飲和順鉑對(duì)MPE和腫瘤生長(zhǎng)均具有一定抑制作用。逐水飲+順鉑組小鼠MPE體積、胸壁轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目、轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量和生存期與逐水飲組和順鉑組比較有明顯差異，提示逐水飲和順鉑聯(lián)用對(duì)腫瘤和MPE的抑制作用更加明顯。化療藥物能直接殺死或抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但副作用明顯，部分患者耐受性較差，結(jié)合中藥逐水飲扶正祛邪，可減輕其毒副作用，改善患者耐受性，促進(jìn)胸腔積液消退［13-14］。研究也證實(shí)中藥口服湯劑（如宣肺逐飲方、溫肺化飲方、葶藶甘遂逐水飲等）聯(lián)合順鉑胸腔灌注治療肺癌MPE的療效較單用順鉑更佳［15］。

MPE的產(chǎn)生、發(fā)展與其微環(huán)境密切相關(guān)，其中免疫細(xì)胞在MPE微環(huán)境中起重要作用，機(jī)體細(xì)胞免疫主要由CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)，已有研究表明MPE中Th17/Treg細(xì)胞失衡提示預(yù)后不良［16-18］。本研究觀察各組小鼠MPE和外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞水平，結(jié)果各組小鼠MPE中Th17、Treg細(xì)胞百分比均高于其外周血。與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Th17細(xì)胞百分比升高，逐水飲組和逐水飲+順鉑組小鼠MPE和外周血中Treg細(xì)胞百分比降低。說明模型組小鼠MPE的微環(huán)境中Treg細(xì)胞較Th17細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，可能因?yàn)樾∈笾苯有厍唤臃N，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過快，免疫功能受到明顯抑制，Treg細(xì)胞升高較Th17細(xì)胞更加明顯，使Th17/Treg平衡偏向Treg細(xì)胞，而逐水飲可逆轉(zhuǎn)Th17/Treg細(xì)胞失衡狀態(tài)。TGF-β是決定初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞或Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子［19］。本研究觀結(jié)果顯示，與模型組比較，逐水飲組、順鉑組和逐水飲+順鉑組MPE和外周血中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23水平升高，Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1水平降低。說明逐水飲可抑制TGF-β1分泌，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化及IL-17、IL-23表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤免疫反應(yīng)，消除胸腔積液。

綜上所述，中藥逐水飲具有一定抑制小鼠胸腔積液的作用，且與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)作用更加明顯。小鼠MPE微環(huán)境中Th17細(xì)胞失衡，逐水飲能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，糾正微環(huán)境中Th17細(xì)胞失衡，減輕MPE微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫作用，發(fā)揮治療MPE作用。