侯公瑾 柏正平 曾普華△ 潘敏求 蔣益蘭 黃惠勇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大疾病，癌性疼痛是中晚期癌癥患者常見的癥狀，其中60%～80%的患者會(huì)發(fā)生癌性疼痛［1］，而晚期患者中90%承受著中重度疼痛及爆發(fā)性疼痛［2］，嚴(yán)重影響患者日常生活、睡眠、精神心理等。世界衛(wèi)生組織WHO提倡“三階梯止痛療法”有效改善了癌性疼痛的治療狀況，但部分因藥物治療帶來的副作用同樣讓人難以忍受。蟾龍鎮(zhèn)痛膏是湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科院內(nèi)制劑，由湖南省名中醫(yī)柏正平教授通過檢索大量古今文獻(xiàn)［3］，結(jié)合全國(guó)名老中醫(yī)潘敏求教授治療癌性疼痛臨床經(jīng)驗(yàn)確立［4］。前期臨床使用發(fā)現(xiàn)其對(duì)輕中度癌性疼痛具有較好療效。本研究建立骨癌痛大鼠模型并以蟾龍鎮(zhèn)痛膏進(jìn)行干預(yù)，探討蟾龍鎮(zhèn)痛膏對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛作用，并基于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路探討可能的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用Walker256乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)于上海滬震生物科技有限公司。SPF級(jí)雌性SD大鼠50只，7周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：蟾龍鎮(zhèn)痛膏（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科制備；由蟾皮、生川烏、雄黃、芒硝、乳香、沒藥、血竭、醋延胡索、明礬、龍葵、冰片組成，外貼凝膠膏藥，院內(nèi)制劑生產(chǎn)批號(hào)20171212-02）；扶他林（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291）。磷酸化38蛋白（p-p38 MAPK）抗體（美國(guó)CST，貨號(hào)#4511）；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK MAPK）抗體（美國(guó)CST，貨號(hào)#4370）；β-actin抗體（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)60008-1-Ig）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific，貨號(hào)23227）。2）儀器：PVDF膜（美國(guó)Bio-RAD，貨號(hào)1620177）；電泳儀（美國(guó)Bio-RAD，貨號(hào)164-5050）；電泳槽（中國(guó)北京六一，貨號(hào)DYCZ-24EN）；轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一，貨號(hào)DYCZ-40A）；電動(dòng)玻璃勻漿器（日本新芝，貨號(hào)DY89-1）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（中國(guó)深圳黑馬，貨號(hào)TGL-18R）；熱板測(cè)痛儀（中國(guó)浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠，貨號(hào)GJ8402-0021）；Von frey纖毛機(jī)械刺激針（美國(guó)North Coast，貨號(hào)12775-99）。

1.3 分組與造模 將50只雌性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組和扶他林組，每組10只，除空白組外其他各組進(jìn)行造模。造模用Walker256乳腺癌細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL），參照Medhurst［5］報(bào)道的方法建立骨癌痛大鼠模型。采用10%水合氯醛（300 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，仰臥位固定于操作臺(tái)上，止血鉗夾取四肢無反應(yīng)后取1 mm微型骨鉆于右側(cè)后肢白色髕韌帶下方脛骨上段部位打孔，刺入骨髓腔后用5 μL微量取樣器注入含有Walker 256乳腺癌細(xì)胞懸液4 μL，注射完畢后用無菌骨蠟封閉鉆孔，生理鹽水沖洗，縫合傷口，消毒傷口后撒青霉素預(yù)防感染。對(duì)造模后的大鼠進(jìn)行疼痛閾值評(píng)估驗(yàn)證造模是否成功。

1.4 給藥方法 造模14 d后開始外敷相應(yīng)藥物：蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組（蟾龍鎮(zhèn)痛膏0.56 g/kg）、蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組（蟾龍鎮(zhèn)痛膏1.12 g/kg）、扶他林組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.08 g/kg）。蟾龍鎮(zhèn)痛膏外敷大鼠背部中央去毛皮膚，醫(yī)用橡皮膠帶環(huán)周固定2圈，保證每日接觸8 h以上；扶他林外涂大鼠背部中央去毛皮膚；每日10∶00給藥1次，連續(xù)21 d?？瞻捉M、模型組不作任何干預(yù)。于溫度（22±1）℃，濕度50%，12 h光照12 h黑暗環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）大鼠脛骨HE染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脊椎脫臼法處死大鼠取右側(cè)脛骨，固定于4%多聚甲醛液體中，24 h后用10%EDTA（pH7.2），4℃脫鈣處理；30 d后取大鼠右側(cè)脛骨上端部位進(jìn)行切片，60℃烤片12 h；將切片于二甲苯溶液中，放置3次，每次20 min。然后依次在100%、100%、95%、85%和75%乙醇，每級(jí)放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染10 min，蒸餾水沖洗，緩沖液返藍(lán)；伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，每級(jí)5 min。取出后于二甲苯溶液中放置2次，每次10 min，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。2）大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）。實(shí)驗(yàn)開始后，每7天測(cè)試1次，測(cè)試時(shí)將熱板測(cè)痛儀溫度設(shè)定為55℃后將大鼠置于測(cè)試平臺(tái)上，參照Yao［6］報(bào)道的方法，記錄大鼠出現(xiàn)舔后足的時(shí)間為PWL，上限值為20 s以避免燙傷大鼠皮膚，取3次平均值，每次測(cè)試間隔5 min。持續(xù)至造模后35 d。3）大鼠機(jī)械痛覺縮足反射閾值（PWT）。實(shí)驗(yàn)開始后，每7天測(cè)試1次，測(cè)試時(shí)將大鼠放入底部為金屬篩網(wǎng)的有機(jī)玻璃籠中適應(yīng)5 min后，參照Chaplan［7］報(bào)道的方法，用Von Frey測(cè)痛纖絲垂直刺激大鼠后足底部中央皮膚，使纖絲彎曲至大鼠出現(xiàn)縮足反射，若未出現(xiàn)發(fā)射則更換更大強(qiáng)度測(cè)痛纖絲。從0.6 g開始，每個(gè)強(qiáng)度的刺激為5次，每隔15 s進(jìn)行一次機(jī)械刺激，將出現(xiàn)縮足表現(xiàn)3次以上的最小Von Frey纖維強(qiáng)度記錄為PWT，上限值為15.0 g。持續(xù)至造模后35 d。4）蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)大鼠脊髓pp38、p-ERK表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠處死，取脊髓L4～L6段取0.025 g，加入200 μL（含蛋白酶抑制劑）RIPA裂解液，置冰浴中勻漿機(jī)勻漿15～20 s，靜置30 min，12000 r/min離心，4℃，15 min，將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中100℃加熱5 min，BCA蛋白含量測(cè)定。將大鼠脊椎用液氮研磨后加入RIPA置于冰上裂解，并將裂解后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至100℃水浴加熱5 min使蛋白變性。蛋白定量，統(tǒng)一總蛋白上樣量為40 μg。聚丙烯酰胺凝膠電泳后將gel轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，恒流200 mA濕轉(zhuǎn)105 min。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜封閉室溫1h（封閉液：PBST+5%脫脂奶粉），分別加pp38、p-ERK抗體（兔抗鼠）按說明書，1∶1000稀釋，4℃過夜。棄一抗，用含有0.05%Tween-20的緩沖液（PBS-T）洗膜3次，10 min/次，加入二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h。棄二抗，PBS-T洗去多余抗體，3次，10 min/次，加入發(fā)光顯示液體，曝光。電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，分析空白組、模型組條帶與各對(duì)照組條帶面積、灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脛骨病理HE染色比較 見圖1?？瞻捉M組織結(jié)構(gòu)未見異常，模型組鏡下可見骨髓腔內(nèi)充滿大量腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小差異明顯，細(xì)胞核、質(zhì)比異常，周圍骨質(zhì)結(jié)構(gòu)部分缺失，骨小梁結(jié)構(gòu)破壞，部分骨皮質(zhì)可見腫瘤細(xì)胞，提示大鼠脛骨接種Walker256細(xì)胞建立骨轉(zhuǎn)移模型成立。

圖1 脛骨病理比較（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠疼痛行為學(xué)比較 見表1～表2。造模后模型組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組、高劑量組PWL、PWT較空白組明顯下降，提示大鼠疼痛閾值降低，骨癌痛大鼠模型造模成功；藥物干預(yù)后蟾龍鎮(zhèn)痛膏正常組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組、扶他林組PWL、PWT較模型組上升（P＜0.05），提示藥物干預(yù)能提高大鼠疼痛閾值；蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組、高劑量組、扶他林組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）比較（s，±s）

表1 各組大鼠熱痛覺縮足反射潛伏期（PWL）比較（s，±s）

與模型組比較，?P＜0.05。下同

組別空白組模型組蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組扶他林組0d 14.47±1.5013.67±1.4113.70±1.5814.33±1.1114.73±0.787d 13.50±1.60*7.33±1.948.37±1.109.53±2.088.53±1.6114d 12.53±1.51*5.33±1.595.00±1.115.40±1.765.67±1.8521d 14.73±1.46*5.27±1.728.73±0.95*6.67±0.779.87±0.89*28d 13.27±1.59*3.67±1.138.30±1.17*7.67±1.21*8.67±0.79*35d 15.07±0.91*3.63±0.7111.67±1.28*10.70±1.16*9.70±1.62*

表2 各組大鼠機(jī)械痛覺縮足反射閾值（PWT）比較（s，±s）

表2 各組大鼠機(jī)械痛覺縮足反射閾值（PWT）比較（s，±s）

組別空白組模型組蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組扶他林組0d 11.22±2.9312.86±2.2512.24±2.6811.20±1.6411.82±1.027d 11.60±1.42*6.62±2.897.64±1.596.12±1.817.34±2.5814d 11.24±1.78*4.24±1.084.40±2.784.84±2.204.86±1.4921d 11.26±2.84*3.84±1.338.72±1.48*9.86±2.29*9.52±2.77*28d 12.46±1.59*3.54±2.8811.52±2.67*9.22±2.34*10.14±2.91*35d 12.86±1.63*4.52±1.5312.14±1.13*12.46±2.86*11.08±1.56*

2.3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達(dá)比較 見圖2，圖3，表3。模型組p-p38、p-ERK表達(dá)較空白組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組、蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組和扶他林組明顯上升（P＜0.05），提示骨癌痛大鼠模型中MAPK信號(hào)通路中p-p38、p-ERK大量激活，藥物干預(yù)后，能夠抑制p-p38、p-ERK的表達(dá)，其中ERK2較ERK1更明顯。

3 討論

圖2 各組大鼠脊髓p-p38灰度圖

圖3 各組大鼠脊髓p-ERK灰度圖

表3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達(dá)比較（s，±s）

表3 各組大鼠脊髓p-p38、p-ERK表達(dá)比較（s，±s）

組別空白組模型組蟾龍鎮(zhèn)痛膏常規(guī)劑量組蟾龍鎮(zhèn)痛膏高劑量組扶他林組n 1010101010 p-p387.07±0.48*38.92±0.9325.40±1.32*23.87±0.82*21.09±1.13*p-ERK17.56±1.42*59.74±1.2627.09±2.93*35.48±2.13*52.98±2.44*p-ERK24.27±1.63*54.44±1.3217.78±1.43*9.97±0.88*9.36±0.93*

近年來研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路在癌性疼痛的產(chǎn)生發(fā)展過程中具有重要作用［8-9］。在各種傷害性疼痛產(chǎn)生過程中p38/MAPK大量活化，引起磷脂酶A2產(chǎn)生花生四烯酸，誘導(dǎo)細(xì)胞外前列腺素E2增加，刺激神經(jīng)元引起疼痛［10］；在脊髓中p38/MAPK信號(hào)通路可以通過激活核因子κB（NF-κB）影響基因轉(zhuǎn)錄，促使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β、TNF-α、IL-6，激活神經(jīng)元上相應(yīng)受體，引起疼痛在中樞的傳遞［11］。有文獻(xiàn)表明，ERK/MAPK通路參與了痛覺超敏的過程，引起疼痛效應(yīng)的放大［12］，在注射完全弗氏佐劑形成的關(guān)節(jié)炎模型中，使用MEK（ERK上游激酶）抑制劑PD98059可以明顯減輕關(guān)節(jié)炎模型痛覺超敏［13］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，骨癌痛大鼠模型中p-p38、p-ERK1/2表達(dá)明顯上升，提示了其在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，而使用蟾龍鎮(zhèn)痛膏、扶他林干預(yù)后，大鼠痛閾下降，脊髓p-p38、p-ERK1/2表達(dá)下降，提示了蟾龍鎮(zhèn)痛膏和扶他林可以抑制脊髓p-p38、p-ERK1/2的活化。

臨床上目前對(duì)癌性疼痛的治療主要采用WHO提倡的“三階梯”止痛療法，其有效降低了癌痛患者的癥狀［14］。扶他林屬于第一階梯非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，可以抑制前列腺素合成，從而降低炎性介質(zhì)的釋放，臨床上對(duì)于各種類型疼痛具有比較好的療效，對(duì)于輕中度骨癌痛也有一定療效［15］，但也有諸多不良反應(yīng)，如肝腎功能損傷、惡心嘔吐、皮膚過敏、消化道潰瘍、出血等。第二、三階梯阿片類鎮(zhèn)痛藥物也同樣有惡心嘔吐、便秘、呼吸抑制等不良反應(yīng)，同時(shí)具有明顯的藥物依賴作用，隨著病情的進(jìn)展，常常會(huì)引起劑量的不斷增加［16］。中醫(yī)學(xué)自古就有各種治療疼痛的記載，包括中藥內(nèi)服法、外治法、針刺法、艾灸法等多種治療方式，其中外治法也包含外用膏藥、擦劑、穴位敷貼等多種形式，在臨床中運(yùn)用較多。外用膏藥可以避免內(nèi)服藥對(duì)集體的刺激［17］，效果也較內(nèi)服法更加明顯［18］，在臨床適用于腫瘤患者，具有簡(jiǎn)便實(shí)用、療效可靠、安全性高的特點(diǎn)。

蟾龍鎮(zhèn)痛膏以性味辛溫，行氣通絡(luò)止痛的雄黃、生川烏、血竭、醋延胡索為君藥；其中雄黃辛溫散結(jié)止痛，川烏性熱味苦，可增強(qiáng)溫通的療效，麻醉止痛；血竭活血止痛，散瘀生新；延胡索性溫，味辛苦，與諸藥性味相合，是止痛專用藥，四藥合用，可溫陽散結(jié)、行氣止痛。蟾皮、芒硝、龍葵等化痰散結(jié)、利水消腫、解毒止痛，能化絡(luò)脈痰濁之邪，達(dá)到通絡(luò)止痛的目的。輔以乳香行氣通絡(luò)、活血止痛，沒藥散瘀止痛；加用冰片、明礬辛香的藥物，芳香走竄，增強(qiáng)皮膚滲透效果以利透皮吸收，也是止痛良藥，可清熱止痛，消腫定痛，并中和諸多溫燥藥物，以達(dá)更好的治療功用，又可助其他藥物吸收擴(kuò)散，上述組成使本方寒熱并用，通絡(luò)止痛，更具解毒散結(jié)功效，以透皮藥物為引藥直達(dá)病痛之所，共奏解毒散結(jié)，活血行氣，通絡(luò)止痛之功效。

本研究初步證實(shí)蟾龍鎮(zhèn)痛膏對(duì)骨癌痛大鼠具有提高疼痛閾值的作用，同時(shí)可降低脊髓p-p38、p-ERK1/2表達(dá)。其鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制可能與抑制脊髓MAPK信號(hào)通路中p38、ERK1/2活化有關(guān)，為探索蟾龍鎮(zhèn)痛膏鎮(zhèn)痛作用機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床應(yīng)用蟾龍鎮(zhèn)痛膏治療癌性疼痛提供了依據(jù)。臨床治療癌性疼痛應(yīng)通過中西醫(yī)結(jié)合綜合治療的方式，重視辨證與辨病相互結(jié)合才能獲得較好的效果。但蟾龍鎮(zhèn)痛膏組方藥物較多，其有效成分及鎮(zhèn)痛機(jī)制仍需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)探索證實(shí)。