馬 瑞 劉王波 周 平

（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

中風(fēng)是世界上第二大常見死亡原因和導(dǎo)致殘疾的主要原因，缺血性卒中的治療方法仍然是當(dāng)前腦血管研究的關(guān)鍵領(lǐng)域之一［1-3］。在缺血后的一段時(shí)間內(nèi)，再灌注對(duì)缺血性腦造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致嚴(yán)重的腦微循環(huán)障礙甚至神經(jīng)元損傷，這與缺血性卒中后的殘疾和死亡率密切相關(guān)［4-6］。沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物1（SIRT1）是NAD+依賴性酶的Sirtuin家族的關(guān)鍵成員，其與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，SIRT1可直接通過磷酸化和去乙?；幕钚杂绊戇^氧化物酶體增殖物激活受體-c共激活劑-1（PGC-1）［7-8］。上調(diào)PGC-1α可通過減輕氧化應(yīng)激來減少神經(jīng)元死亡。多項(xiàng)研究表明，SIRT1、PGC-1信號(hào)通路的激活可發(fā)揮抗腦局灶性腦缺血再灌注損傷的作用，SIRT1、PGC-1可通過磷酸化后滅活促凋亡蛋白［9］。芪蝎活血通絡(luò)湯具有活絡(luò)除濕、化瘀止痛的功效［10］，本研究擬探討芪蝎活血通絡(luò)湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及SIRT1、PGC-1表達(dá)的影響，為局灶性腦缺血再灌注損傷的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠100只，8周齡；體質(zhì)量280～300 g；河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（證書號(hào)907048）提供，大鼠圈養(yǎng)在環(huán)境控制的繁殖室（溫度22～24℃；濕度50%～55%；12 h黑暗/12 h光照循環(huán)）中，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物和水。

1.2 試藥與儀器 芪蝎活血通絡(luò)湯組方為：黃芪120 g，全蝎20 g，川芎、當(dāng)歸、赤芍、桃仁及地龍各15 g，雞血藤及丹參各30 g，紅花及甘草各10 g。水煎300 mL，濃縮至50 mL。根據(jù)成人與大鼠劑量公式換算，以10.0 mL/kg體質(zhì)量灌胃，將藥液配制成為10.0 g/mL。TRIzol Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；大鼠 SIRT1（＃Rn00567167_mL），大鼠PGC-1（#Rn00492539_mL），大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（＃Rn01775763_g1）的TaqMan基因表達(dá)分析購(gòu)自Applied Biosystems（Foster City，CA，USA）。兔多克隆抗 SIRT1、PGC-1抗體（抗 SIRT1；目錄號(hào)BA0565-1；抗PGC-1；目錄號(hào)BA0890；1∶50，來自武漢博士特生物技術(shù)有限公司）；多克隆山羊抗兔IgG/鏈霉抗生物素蛋白抗體；Ori-Gene Technologies，Inc，Beijing，China；SIRT1、PGC-13試劑盒（SIRT1目錄號(hào)SXM026、PGC-13目錄號(hào)SX01165，上海森雄生物科技產(chǎn)業(yè)有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺試劑盒（DAB，目錄號(hào)AR1022，武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。分光光度計(jì)SmartSpec 3000（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。

1.3 造模與分組 根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、芪蝎活血通絡(luò)湯低劑量組（2.0 mg/kg）、芪蝎活血通絡(luò)湯中劑量組（4.0 mg/kg）、芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組（8.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。模型組、芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組腔注射戊巴比妥腹麻醉后，通過頸中線切口分離左頸總動(dòng)脈（CCA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。將預(yù)先涂有硅橡膠（外徑0.26 mm）的尼龍單絲插入CCA并進(jìn)入ICA至左側(cè)CCA分叉處約19～20 mm以閉塞大腦中動(dòng)脈。然后，在誘導(dǎo)缺血后2 h，緩慢取出皮膚并將動(dòng)物放回籠中再灌注22 h。對(duì)照組的大鼠只切開皮膚和分離血管，不進(jìn)行阻塞血流。在整個(gè)外科手術(shù)過程中，使用紅外燈將大鼠體溫維持在37℃。術(shù)后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。

1.4 給藥方法 芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組術(shù)后第1天開始腹腔給予相應(yīng)劑量藥物，對(duì)照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)給予4周。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 以盲控方式記錄缺血性損傷后7、14 d每只大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

1.6 貼紙去除及平衡木行走實(shí)驗(yàn)［11-12］采用2片10 mm的正方形黏性紙粘住大鼠2個(gè)前肢掌面，記錄大鼠去除兩側(cè)紙片的總時(shí)間為雙側(cè)貼紙去除時(shí)間。105 cm×4 cm×3 cm的平衡木離地80 cm，起始點(diǎn)為陡峭平臺(tái)，終點(diǎn)為一平臺(tái)，記錄大鼠通過整個(gè)平衡木的時(shí)間為平衡木過桿時(shí)間。

1.7 大鼠海馬組織中SIRT1、PGC-1 mRNA水平測(cè)定 取大鼠海馬組織于1 mL TRIzol Reagent中勻漿。加入0.2 mL氯仿后，將混合物在4℃下以12000 g離心15 min。將水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5 mL異丙醇。在4℃下以10000 g離心10 min后，用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，并在4℃下以7500 g離心5 min。然后將RNA沉淀物風(fēng)干并溶解在不含RNase的水中。為了測(cè)定RNA濃度，使用分光光度計(jì)SmartSpec 3000測(cè)量260 nm處的吸光度。使用TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit和StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行RTPCR。

1.8 SIRT1、PGC-1蛋白在大鼠海馬組織的表達(dá)水平測(cè)定 取大鼠海馬組織石蠟包埋切片用于檢測(cè)SIRT1、PGC-1的表達(dá)。將切片脫蠟，用分級(jí)的醇系列再水化并用PBS洗滌。然后將切片在室溫下在3%H2O2中溫育10 min以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性并在PBS中漂洗。將切片與兔多克隆抗SIRT1、PGC-1抗體一起孵育。然后在PBS中在37℃下保持2 h。然后將切片與生物素標(biāo)記的二抗在37℃下孵育30 min。在兩個(gè)高倍顯微鏡下評(píng)估每個(gè)切片中皮質(zhì)和海馬SIRT1、PGC-1的表達(dá)水平。ELISA測(cè)定大鼠海馬組織中SIRT1、PGC-1蛋白水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)比較，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組缺血損傷后7、14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組7、14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（分，±s）

與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組芪蝎活血通絡(luò)湯低劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯中劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組n 20202020207 d 0±010.66±0.47*8.14±0.34*△6.23±0.23*△5.35±0.16*△14 d 0±08.75±0.37*5.35±0.31*△4.91±0.26*△3.51±0.30*△

2.2 各組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間比較（s，±s）

表2 各組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間比較（s，±s）

組別對(duì)照組模型組芪蝎活血通絡(luò)湯低劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯中劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組n 2020202020雙側(cè)貼紙去除時(shí)間26.34±6.87103.63±25.65*80.76±8.12*△51.28±9.88*△50.32±9.16*△平衡木過桿時(shí)間1.99±0.3416.54±6.87*12.30±0.51*△8.65±0.51*△4.71±0.50*△

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響 見圖1。對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央。模型組海馬區(qū)可見大量壞死神經(jīng)元，且細(xì)胞脫失現(xiàn)象明顯，細(xì)胞核固縮。芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組海馬區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，且神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，神經(jīng)元細(xì)胞核呈卵圓形位于中央，分布均勻。芪蝎活血通絡(luò)湯中、低劑量組較模型組而言，壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少，但神經(jīng)元細(xì)胞疏松紊亂，細(xì)胞核固縮，脫失現(xiàn)象明顯，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達(dá)水平比較見表3。與對(duì)照組比較，模型組SIRT1、PGC-1 mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組SIRT1、PGC-1 mRNA水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組芪蝎活血通絡(luò)湯低劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯中劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組n 2020202020 SIRT11.94±0.110.56±0.13*0.91±0.18*△1.49±0.20*△1.78±0.11*△PGC-11.76±0.170.98±0.12*1.57±0.17*△1.09±0.17*△1.12±0.16△

2.5 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達(dá)水平比較 見表4，圖2～圖3。與對(duì)照組組比較，模型組SIRT1、PGC-1蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組SIRT1、PGC-1蛋白水平升高（P＜0.05）。免疫組化法下，SIRT1、PGC-1陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色，各組SIRT1、PGC-1陽(yáng)性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注損傷SIRT1表達(dá)（DAB，400倍）

圖3 各組大鼠腦缺血再灌注損傷PGC-1表達(dá)（DAB，400倍）

3 討 論

芪蝎活血通絡(luò)湯具有多重生物活性，包括鎮(zhèn)痛，擴(kuò)張血管，降低血漿黏度，抑制血小板聚集，抗血栓和增強(qiáng)抗缺氧能力等。研究證明，芪蝎活血通絡(luò)湯含有黃酮類化合物，其具有抗腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用［13］。研究結(jié)果顯示，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組7、14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間降低，且隨著芪蝎活血通絡(luò)湯給藥劑量的增加，7、14 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過桿時(shí)間逐漸降低，結(jié)合病理學(xué)結(jié)果芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組海馬區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，且神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，神經(jīng)元細(xì)胞核呈卵圓形位于中央，分布均勻；芪蝎活血通絡(luò)湯中、低劑量組較模型組而言，壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少，但經(jīng)元疏松紊亂，細(xì)胞核固縮，脫失現(xiàn)象明顯，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。這說明，芪蝎活血通絡(luò)湯能明顯減輕局灶性腦缺血再灌注損傷程度，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

表4 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

表4 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

組別對(duì)照組模型組芪蝎活血通絡(luò)湯低劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯中劑量組芪蝎活血通絡(luò)湯高劑量組n 2020202020 SIRT1183.67±15.6371.14±16.78103.73±13.65*△123.17±99.69*△152.58±13.74*△PGC-1145.77±6.4667.86±6.98139.58±8.9789.45±6.98*△120.15±10.69△

SIRT1最近被發(fā)現(xiàn)是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的去乙?；鞍酌?，其在長(zhǎng)壽和應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［14］。在缺血再灌注神經(jīng)損傷中，SIRT1活性的抑制與腦缺血和再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡有關(guān)。然而，改善SIRT1活性有助于缺血性腦的抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用。研究已經(jīng)證實(shí)Akt的乙?；⊿er473）是SIRT1完全啟動(dòng)其激活所必需的［15］。通過激酶和PH結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用，SIRT1通常維持在無活性狀態(tài)，而Akt的PH結(jié)構(gòu)域和3種乙?；≤罩g的相互作用使得乙酰經(jīng)歷重要的構(gòu)象變化，這使得激活物能夠接近激活環(huán)并且乙?；疉kt中Thr308的位點(diǎn)［16］。疏水基序中Ser473的乙酰化是Akt最大活化的先決條件。SIRT1的過表達(dá)激活了PGC-1對(duì)細(xì)胞存活以及線粒體活性的轉(zhuǎn)錄活性。SIRT1直接使蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域中的PGC-1去乙?；?，形成控制代謝基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。以這種方式，產(chǎn)生更多的能量。近期研究表明，PGC-1是調(diào)節(jié)內(nèi)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)主要因素。PGC-1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)中，能被內(nèi)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)激活，此外過量的Ca2+水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量蛋白沉淀均可激活PGC-1，PGC-1可直接抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性，來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程；此外，PGC-1也可通過P21間接抑制Caspase；PGC-1與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4結(jié)合，導(dǎo)致CDK2/cyclin-E激活和核糖體（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入周期，加快G1/S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)而阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［17-19］。本次研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白水平降低；與模型組比較，芪蝎活血通絡(luò)湯各劑量組SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白水平升高。這提示芪蝎活血通絡(luò)湯能促進(jìn)SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，芪蝎活血通絡(luò)湯能明顯減輕局灶性腦缺血再灌注損傷程度，具有神經(jīng)保護(hù)作用；其機(jī)制與蝎活血通絡(luò)湯能促進(jìn)SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。