王超，楊曉燕，高鳳霞，吳劍，戴天陽(yáng)

0 引言

我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)[1]，2016年癌癥數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，食管癌在我國(guó)人群中總發(fā)病率居第3位，總死亡率居第4位[2]。食管癌病死率高且其5年生存率不到30%，預(yù)后不佳[3]。隨著免疫治療的進(jìn)展，免疫因素在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視，但主要集中在基于T細(xì)胞的抗腫瘤治療。自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞是人體內(nèi)非特異性免疫系統(tǒng)的主要組成部分，與T細(xì)胞不同，其無(wú)需預(yù)先致敏即可產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子，對(duì)腫瘤和靶細(xì)胞起到殺傷作用[4]。而NK細(xì)胞的殺傷能力與其表面受體的表達(dá)密切相關(guān)；其中，活化性受體自然細(xì)胞毒受體家族（NKp30、NKp44、NKp46）、NKG2D、與細(xì)胞毒作用緊密相關(guān)的CD16、與NK細(xì)胞成熟相關(guān)的抑制性受體NKG2A都是NK細(xì)胞表面重要的受體。

多種實(shí)體腫瘤的相關(guān)研究表明，NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)失衡與腫瘤的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[5]。目前針對(duì)NK細(xì)胞的研究主要集中在外周血NK細(xì)胞的數(shù)量。因此，本研究探討食管鱗癌患者外周血及組織中NK細(xì)胞的表型、NK細(xì)胞的比例和表面受體表達(dá)，以期為探討食管鱗癌免疫逃逸的機(jī)制和免疫治療提供基礎(chǔ)研究的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年4月—2017年9月間于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸心外科確診為食管鱗癌的患者52例；其中男48例、女4例，年齡42～80歲，平均（61.56±8.16）歲。所有患者術(shù)前均行胃鏡檢查明確診斷為食管鱗癌，且既往均未接受過(guò)手術(shù)、化療、放療或其他方式的治療，無(wú)慢性感染性病變及其他免疫系統(tǒng)疾病，術(shù)后病理組織學(xué)再次證實(shí)為食管鱗癌，并依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）與美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）聯(lián)合發(fā)布的第8版分期標(biāo)準(zhǔn)行食管癌TNM分期。52例食管鱗癌患者中Ⅰ期17例、Ⅱ期8例、Ⅲ期24例、Ⅳ期3例，35例健康者外周血作為正常對(duì)照組。

1.2 標(biāo)本采集

食管鱗癌患者術(shù)前用肝素抗凝管采集外周靜脈血3 ml。同一患者在術(shù)中切除病變組織后，根據(jù)組織標(biāo)本的特征分別取食管鱗癌組織、以距離癌邊緣5 cm以遠(yuǎn)的非腫瘤正常食管組織各一塊裝入無(wú)菌標(biāo)本袋中，用4℃冰盒在1 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。健康者血液標(biāo)本同樣用肝素抗凝管采集外周靜脈血3 ml。

1.3 試劑和儀器

試劑：熒光標(biāo)記抗體（FITC-conjugated antihuman CD3，APC-conjugated anti-human CD56，PE-Cy7-conjugated anti-human CD16，PE-conjugated anti-human NKp30，PE-conjugated anti-human NKp44，PE-conjugated anti-human NKp46，PerCPCy5.5-conjugated anti-human NKG2A、PerCP-Cy5.5-conjugated anti-human NKG2D）（所有抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司），人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)蠊荆?，PBS緩沖液（北京索萊寶公司）。

儀器：一次性多功能過(guò)濾器、高速離心機(jī)、15、50 ml 離心管、流式細(xì)胞分析儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）分離 取3 ml淋巴細(xì)胞分離液加入15 ml離心管中；用吸管小心吸取健康者或食管鱗癌患者外周靜脈血3 ml，緩慢加于分離液的液面上，650 g離心30 min；離心后，小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一15 ml離心管中，并加入10 ml無(wú)菌PBS，重懸細(xì)胞；再次4℃、250 g離心10 min，棄上清液后加入5 ml PBS重懸，洗滌2次（4℃、250 g 5 min），得到所需PBMC，用1 ml PBS重懸細(xì)胞備用。

1.4.2 組織單細(xì)胞懸液獲取 腫瘤組織和正常組織均采用機(jī)械網(wǎng)搓法，將具有200目濾網(wǎng)的一次性多功能過(guò)濾器放置于15 ml試管上。把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用PBS沖洗，直到將組織搓完，得到腫瘤組織及正常組織單細(xì)胞懸液。

1.4.3 組織單個(gè)核細(xì)胞（Tissue mononuclear cell,TMC）分離 取5 ml淋巴細(xì)胞分離液加入15 ml離心管；將得到的單細(xì)胞懸液取5 ml緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的液面上，650 g 離心30 min；吸取云霧狀中間層后加入10 ml無(wú)菌PBS混勻，在4℃恒溫離心機(jī)中230 g離心10 min，棄上清液后加入5 ml PBS重懸洗滌1次（4℃、230 g 5 min）再用1 ml PBS重懸得到所需組織中單核細(xì)胞。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC及TMC中NK細(xì)胞比例和表面受體的表達(dá) 取PBMC（或TMC）10 μl加入流式檢測(cè)管中，再加入190 μl PBS上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)；取200 μl PBMC（或TMC）根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按試劑說(shuō)明書加入相應(yīng)劑量的細(xì)胞表面分子染色抗體，放入4℃冰箱避光孵育30 min；向每管中加入1 ml PBS進(jìn)行重懸，室溫、135 g離心5 min；向每孔加入200 μl PBS重懸后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。采用方差齊性檢驗(yàn)判斷兩組間方差齊性，當(dāng)兩者間方差齊時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異；方差不齊則采用t'檢驗(yàn)；配對(duì)設(shè)計(jì)采用配對(duì)t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細(xì)胞的分布

食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞比例與健康者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（（18.79±1.330）%vs.（16.47±1.100）%, P=0.1812），見圖1A；食管鱗癌組織中NK細(xì)胞比例明顯高于正常組織（（4.10±0.370）% vs. （2.48±0.430）% , P=0.0023），見圖1B。

2.2 NK細(xì)胞表面受體的檢測(cè)

食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞表面活化性受體NKp46、NKG2D的表達(dá)明顯低于健康者，NKp44的表達(dá)明顯高于健康者，NKp30、CD16的表達(dá)無(wú)明顯差異；抑制性受體NKG2A的表達(dá)明顯低于健康者，見表1、圖2A。

活化性受體NKp30、CD16、NKG2D在食管鱗癌組織的表達(dá)明顯低于正常組織；NKp44、NKp46在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織。抑制性受體NKG2A在兩者中的表達(dá)無(wú)明顯差異，見表1、圖2B。

圖1 NK細(xì)胞在食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中的比例Figure1 Ratio of NK cells in peripheral blood(A) and cancer tissues(B) of ESCC patients

2.3 同一食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細(xì)胞表面受體分子表達(dá)情況分析

同一患者外周血NK細(xì)胞和癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)分析，比較兩者表面受體表達(dá)差異。結(jié)果提示癌組織中的NK細(xì)胞活化性受體NKp44表達(dá)量較外周血明顯升高（P＜0.0001），其他活化性受體NKp30、CD16、NKG2D在腫瘤組織中表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），NKp46在腫瘤組織中表達(dá)量雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1020）；抑制性受體NKG2A表達(dá)則明顯升高，見表2、圖3。

2.4 食管鱗癌患者外周血及腫瘤中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞比例與腫瘤分期相關(guān)性分析

隨著腫瘤進(jìn)展，食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞逐漸減少（r=-0.276； P=0.0476）； 腫瘤侵襲程度越高癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞越少（r=-0.2842；P=0.0412）。外周血與癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞數(shù)與腫瘤進(jìn)展成負(fù)相關(guān)，見圖4。

2.5 食管鱗癌患者外周血及癌組織中NK細(xì)胞亞型分析

結(jié)果顯示：食管鱗癌組織中NK細(xì)胞仍主要為CD56dim亞群細(xì)胞，見圖5。提示食管鱗癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞與外周血中的NK細(xì)胞可能為同一亞群細(xì)胞。

表1 NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)結(jié)果Table1 Expression of NK cells surface receptors

3 討論

腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視密切相關(guān)[6]。NK細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，在機(jī)體免疫監(jiān)視中起著重要的作用。相關(guān)研究結(jié)果顯示: 晚期小細(xì)胞肺癌患者外周血中NK細(xì)胞比例較健康者升高，提示細(xì)胞免疫已嚴(yán)重受損時(shí)，天然免疫可能成為晚期患者有力的補(bǔ)充[7]。汪茜茜[8]、劉啟勝[9]等對(duì)食管癌患者外周血中NK細(xì)胞比例分析結(jié)果顯示，食管癌患者外周血中NK細(xì)胞比例高于健康者。本研究結(jié)果與之一致，但可能因標(biāo)本數(shù)量原因未能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相關(guān)文獻(xiàn)表明，NK細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞因子作用被募集到腫瘤微環(huán)境中，參與抗腫瘤作用[10]。由此推測(cè)食管鱗癌微環(huán)境可能從外周血中招募NK細(xì)胞到達(dá)腫瘤組織或可能刺激腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞增殖，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示食管鱗癌外周血及癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞比例與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血和食管癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞比例均與腫瘤分期、良好的預(yù)后相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果與他們的報(bào)道相一致。

圖2 食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)Figure2 Expression of NK cells surface receptors in peripheral blood(A) and tissues(B) of ESCC patients

表2 同一食管鱗癌患者外周血和癌組織NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)Table2 Comparison of NK cells surface receptor expression in peripheral blood and cancer tissues of the same patient

NK細(xì)胞的功能取決于其表面受體的表達(dá)情況[13]。NKp30、NKp44、NKp46組成了自然細(xì)胞毒受體家族（natural cytotoxicity receptors,NCR）是NK細(xì)胞表面重要的活化性受體，對(duì)NK細(xì)胞免疫功能起著重要的作用，其中NKp44僅表達(dá)于激活的NK細(xì)胞表面[14]；CD16是NK細(xì)胞啟動(dòng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）重要的活性受體[15]；NKG2D同樣作為NK細(xì)胞表面重要的活化性受體，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤微環(huán)境中TGF-β對(duì)抑制該活性受體的表達(dá)有明顯的下調(diào)作用[16]。NK細(xì)胞主要的抑制性受體NKG2A與NK細(xì)胞的成熟相關(guān)[17]。本研究結(jié)果表明：盡管食管鱗癌患者外周血中NKp44的表達(dá)明顯高于健康者，但兩者的表達(dá)量均不足1%，因?yàn)镹Kp44僅表達(dá)在激活的NK細(xì)胞表面，該結(jié)果提示食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞可能并未被激活，而與NK細(xì)胞啟動(dòng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用相關(guān)的、重要的活性受體CD16的表達(dá)兩者并無(wú)差異，且均為高表達(dá)；提示食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞未被激活且仍可能發(fā)揮正常的免疫功能。癌組織中檢測(cè)結(jié)果表明：NKp44在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織、CD16的表達(dá)量則明顯低于正常組織；提示食管鱗癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞被激活，但其細(xì)胞毒性作用可能減弱。

圖3 同一食管癌患者外周血和癌組織中NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)Figure3 Expression of NK cells surface receptor in peripheral blood and cancer tissues of the same patient

圖4 食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細(xì)胞比例與TNM分期的相關(guān)性Figure4 Correlation between TNM staging and NK cell ratio in peripheral blood and cancer tissue of ESCC patients

相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，人類外周血中NK細(xì)胞主要為CD56dim細(xì)胞，其CD16高表達(dá)，細(xì)胞毒活性強(qiáng)，以發(fā)揮殺傷功能為主；組織中NK細(xì)胞則主要為CD56bright細(xì)胞，其CD16低表達(dá)，以分泌細(xì)胞因子為主，兩亞群細(xì)胞功能上存在差異[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中NK細(xì)胞仍主要為CD56dim亞群細(xì)胞，提示食管鱗癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞與外周血中的NK細(xì)胞可能為同一亞群細(xì)胞。外國(guó)學(xué)者[19]對(duì)肺癌患者NK細(xì)胞分析同樣發(fā)現(xiàn)，外周血中NK細(xì)胞可被招募到腫瘤組織中，但腫瘤細(xì)胞可通過(guò)調(diào)解自身細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)降低被招募而來(lái)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本研究通過(guò)對(duì)同一患者外周血及癌組織中NK細(xì)胞表面受體表達(dá)情況配對(duì)分析結(jié)果提示：當(dāng)外周血中的NK細(xì)胞被招募到食管鱗癌組織中后被激活（NKp44的表達(dá)量從外周血中不足1%的表達(dá)，變?yōu)?3%）；但其CD16的表達(dá)量則被明顯降低（在外周血中的表達(dá)為97.9%，在癌組織中則為52.56%），說(shuō)明NK細(xì)胞的ADCC作用被削弱，同時(shí)其他活化性受體NKp30、NKp46、NKG2D在腫瘤組織中表達(dá)量也被降低，但抑制性受體NKG2A的表達(dá)則被增強(qiáng)。相關(guān)研究表明隨著NK細(xì)胞的成熟，NKG2A在正常CD56dim亞群NK細(xì)胞中為低表達(dá)[20]，說(shuō)明癌組織中的NK細(xì)胞可能為不成熟的NK細(xì)胞或者腫瘤微環(huán)境可能逆轉(zhuǎn)了NK細(xì)胞的成熟。因此推測(cè)，食管鱗癌患者外周血中NK細(xì)胞具有同健康者相同的免疫功能，當(dāng)被招募到癌組織中后雖然能被激活，但其可能受到腫瘤微環(huán)境的影響表面受體表達(dá)失衡，其細(xì)胞毒性功能可能減弱，這可能介導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生腫瘤免疫逃逸。

綜上，推測(cè)食管鱗癌組織中NK細(xì)胞表面受體表達(dá)失衡是導(dǎo)致其免疫功能減弱、介導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的原因之一，為進(jìn)一步探討食管鱗癌中NK細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制提供依據(jù)。

圖5 食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中NK細(xì)胞亞群分析Figure5 NK subsets in peripheral blood(A) and tissues(B) of ESCC patients