李佛生，汪紅，李一璠，王 甜，樊 佳，王茂林，林宏輝

分子生物學實驗教學中液相Northern雜交檢測microRNA實驗探索

李佛生，汪紅，李一璠，王 甜，樊 佳，王茂林，林宏輝

（四川大學 生命科學學院 生物科學實驗教學中心，四川 成都 610065）

為了豐富分子生物學實驗教學內(nèi)容，加深學生對分子雜交原理等專業(yè)理論知識的理解，在分子生物學實驗教學中開展液相Northern雜交檢測microRNA的實驗探索。利用熒光標記的寡核苷酸做探針，通過探針靈敏性、雜交溫度、雜交時間和雜交液等不同雜交條件的探索，從而簡便、準確、靈敏地雜交檢測不同植物中的microRNA。整個實驗過程僅需幾個小時即可完成，且實驗結(jié)果直觀生動。

分子生物學；實驗教學；液相Northern雜交；分子檢測；microRNA

microRNA（miRNA）是一類長約18~25 nt的內(nèi)源非編碼單鏈小分子RNA，廣泛分布在植物、動物與微生物及病毒中，具有重要的生物學作用[1-3]。自2002年被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA一直是生命科學研究中最熱門的課題之一。要研究miRNA的功能和機制，必須掌握檢測miRNA的方法。目前，熒光定量PCR和高通量芯片技術(shù)已經(jīng)得到了很大的發(fā)展，但是North-ern雜交仍是檢測miRNA表達最主要的手段[4-7]。盡管傳統(tǒng)的Northern雜交屬于分子生物學中的經(jīng)典實驗之一，但是由于其操作復雜、耗時過長，且使用同位素進行標記[8]，在本科實驗教學中開展難度較大。為了豐富分子生物學實驗教學內(nèi)容，加深學生對分子雜交原理等專業(yè)理論知識的理解，本文進行了液相Northern雜交方法檢測miRNA的實驗探索，利用熒光標記的寡核苷酸做探針，通過對探針靈敏性、雜交溫度、雜交時間和雜交液等不同雜交條件的探索，簡便、準確、靈敏地雜交檢測不同植物中的miRNA，整個過程僅需幾個小時即可完成，且實驗結(jié)果直觀生動，比較適合在本科分子生物學實驗教學中開展推廣[4]。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

植物材料：水稻幼苗，煙草幼苗，擬南芥幼苗，小麥幼苗，玉米幼苗

1.2 主要儀器與試劑

（1）Dark Reader transilluminators（clare chemical research, Inc.）、蛋白電泳系統(tǒng)Mini-PROTEANR?Tetra System（BIO-RAD）、電泳儀電源PowerpacTMBasic (BIO-RAD)、Centrifuge 5424離心機（Eppendorf公司）、PCR儀T100TMThermal Cycler（BIO-RAD）、紫外凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+（BIO-RAD）。

（2）DEPC和EDTA購自Amresco公司；核酸外切酶 I 購自NEW ENGLAND BioLabs（M0293）；TRIzol試劑購自Ambion公司；磷酸鹽、檸檬酸鈉、NaCl、甲酰胺、丙烯酰胺、Tris-HCl（Ph8.8）、過硫酸銨（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、氯仿、異丙醇、75%乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 試劑配制

（1）雜交液1：0.1%的DEPC、10 mmol/L EDTA；雜交液2：30 mmol/L磷酸鹽緩沖液、10 mmol/L EDTA；雜交液3：0.3 mol/L NaCl、30 mmol/L磷酸鹽緩沖液、10 mmol/L EDTA；雜交液4：2×SSC、10 mmol/L EDTA。

（2）15% TBE聚丙烯酰胺凝膠（總量為12 ml）∶3.3 ml蒸餾水，7.5 ml 30%丙烯酰胺，1.2 ml 10×TBE，120 μl過硫酸銨(APS)，加入6 μl促凝劑四甲基二乙胺（TEMED），混勻后迅速灌膠。

1.4 探針及序列合成

根據(jù)水稻Osa-miR156的序列5￠-UGA CAG AAG AGA GUG AGC AC-3￠[9]，進行設(shè)計并合成互補的寡核苷酸，并在5￠端增加2個核苷酸殘基后用熒光素FITC標記后即為探針Osa-miD156*，5￠-(FITC)-ACGT GCT CAC TCT CTT CTG TCA-3￠；同時，以此設(shè)計并合成相同的寡核苷酸序列Osa-miD156，5￠-TGA CAG AAG AGA GTG AGC AC-3￠。

1.5 總RNA的提取

取0.1 g植物葉片，在液氮中研磨成粉后轉(zhuǎn)入預冷的1.5 ml離心管，并加入1 ml TRIzol，迅速混勻；室溫靜置5 min后，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫靜置5 min；4 ℃ 12000 rpm離心10 min，小心吸取上清500~600 μl轉(zhuǎn)移至新離心管中；加入500 μl的異丙醇，輕柔顛倒混勻，室溫靜置5～10 min；4 ℃12000 rpm離心10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，渦旋振蕩；4 ℃ 12000 rpm離心5 min，棄上清；乙醇揮發(fā)后，加30~40 μl滅菌0.1‰ DEPC處理水溶解RNA沉淀，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 液相雜交

在200 μl EP管中，先加入1~2 μg之前提取的RNA或者合成的寡核苷酸序列Osa-miD156，加入探針Osa-miD156*，補充雜交液至16 μl。充分混勻后整個反應體系于94 ℃變性5 min，42 ℃雜交60 min。雜交結(jié)束后加入2 μl核酸外切酶Ⅰ和2 μl酶切緩沖液，充分混勻，37 ℃保溫30 min，以消化未雜交的單鏈。

1.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測雜交條帶

制備非變性的15%的TBE聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，將酶切完畢的液相雜交樣品全部上樣，上樣緩沖液為10×DNA loading buffer，90 V電泳30 min。電泳結(jié)束后，取出電泳膠置于Dark Reader transillu-minators上觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相雜交探針靈敏性檢測

首先，為了讓學生了解分子雜交有一定的檢測極限，進行液相雜交中探針靈敏性檢測。取4支200 μl EP管加入過量的Osa-miD156，再分別取10 pmol、1 pmol、0.1 pmol、0.01 pmol濃度的FITC標記的探針Osa-miD156*，補足雜交液至16 μl，混勻后42 ℃雜交60 min。雜交完成后用核酸外切酶Ⅰ37 ℃消化30 min，凝膠電泳檢測實驗結(jié)果。實驗結(jié)果表明，探針濃度為10 pmol、1 pmol以及0.1 pmol時均有雜交條帶，但是探針濃度為0.01 pmol時未見雜交條帶（見圖1），因此，F(xiàn)ITC熒光探針的靈敏度可達0.1 pmol。

圖1 不同濃度探針Osa-miR156*靈敏性的檢測

2.2 雜交溫度檢測

為了讓學生進一步理解雜交溫度對分子雜交效果的影響，設(shè)計液相雜交的溫度梯度分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃。我們分別于8支200 μl EP管中加入適量的探針Osa-miD156* 和適量的Osa-miD156合成序列，補足雜交液至16 μl，混勻后分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃條件下雜交1 h。雜交完成后用核酸外切酶Ⅰ37 ℃消化30 min，凝膠電泳檢測實驗結(jié)果。

電泳檢測結(jié)果顯示，在30 ℃~60 ℃之間，液相雜交結(jié)果相差不大，但是在40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下，雜交效果要稍微好一些（見圖2）。

圖2 不同雜交溫度對液相雜交效果的影響

2.3 雜交時間檢測

由于不同雜交方法對時間的要求不一樣，而雜交時間也嚴重影響到雜交效果[8]，因此，為了確定液相雜交所需雜交時間，分別于4支200 μl EP管中加入適量的探針Osa-miD156*和適量的Osa-miD156合成序列，補足雜交液至16 μl，混勻后在42 ℃條件下分別雜交4 h、2 h、1 h和0.5 h。雜交完成后用核酸外切酶Ⅰ37 ℃消化30 min，凝膠電泳檢測實驗結(jié)果。

電泳結(jié)果顯示，42 ℃下液相雜交0.5 h即可顯示出雜交信號來，雜交時間更長也不會明顯改善雜交效果（見圖3）。這樣可以大大縮短該實驗項目的教學時長，使其更加適合在分子生物學實驗教學中開展。

圖3 不同雜交時間對液相雜交效果的影響

2.4 雜交液的選取

為了選取最合適的雜交液，用水稻幼苗提取的總RNA作為樣本，總共選取了4種雜交液：雜交液1（Buffer 1）為0.1%的DEPC和10 mmol/L EDTA；雜交液2（Buffer 2）為30 mmol/L磷酸鹽緩沖液和10 mmol/L EDTA；雜交液3（Buffer 3）為0.3 mol/L NaCl、30 mmol/L磷酸鹽緩沖液和10 mmol/L EDTA；雜交液4（Buffer 4）為2×SSC和10 mmol/L EDTA。分別在4支200 μl EP管中加入5 μg總RNA（632.5 ng/μl）和適量的探針Osa-miD156*，補足相應雜交液至16 μl，混勻后在42 ℃條件下分別雜交1 h。雜交完成后用核酸外切酶Ⅰ37 ℃消化30 min，凝膠電泳檢測實驗結(jié)果。

從凝膠電泳圖中可以看出，在4種不同雜交液條件下進行液相雜交都有條帶顯示，但雜交液3的條帶要亮一些（見圖4）。結(jié)果顯示液相雜交只需要基礎(chǔ)的鹽溶液作為雜交液就夠了，并且需要適當?shù)膒H值和防降解溶液。

圖4 不同雜交液條件下液相雜交的效果

2.5 液相雜交檢測不同植物中miRNA

應用前面探索好的液相雜交條件，對不同植物中miRNA進行液相雜交檢測。分別提取了水稻、小麥、擬南芥、玉米和煙草幼苗的總RNA作為雜交樣本，使用適量的FITC標記的探針Osa-miD156*，補足雜交液至16 μl，混勻后在42 ℃條件下分別雜交1 h。雜交完成后用核酸外切酶Ⅰ37 ℃消化30 min，凝膠電泳檢測實驗結(jié)果。

凝膠電泳結(jié)果顯示，對水稻、小麥、擬南芥、玉米和煙草的總RNA樣品進行液相雜交檢測均有條帶顯示（見圖5）。這說明這些植物中均含有miR156，也證實了液相雜交檢測miRNA的可行性。

圖5 在最優(yōu)化的雜交條件下液相雜交檢測不同植物中miRNA

3 結(jié)語

分子生物學實驗技術(shù)的發(fā)展日新月異，必須與時俱進，不斷學習和掌握學科研究的前沿和動態(tài)，充實教學內(nèi)容，提高教學質(zhì)量。液相Northern雜交檢測miRNA的實驗屬于科學前沿技術(shù)，且與傳統(tǒng)的Northern雜交相比，該方法操作步驟簡單，所需檢測時間較短，對人危險性小，對環(huán)境友好，且實驗結(jié)果直觀生動，比較適宜在本科分子生物學實驗教學中開展。通過本實驗項目的開展豐富了本科分子生物學實驗教學中分子雜交實驗內(nèi)容。本實驗項目可以與植物總RNA/小RNA的分離提取實驗一起形成綜合性創(chuàng)新實驗項目，有利于學生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。學生先通過探針靈敏度檢測以及雜交溫度、雜交時間檢測和雜交緩沖液等不同雜交條件的探索來加深對分子雜交相關(guān)理論知識的認識，通過檢測不同植物中miRNA的存在，理解miRNA在植物中的普遍性和重要性。另外，miRNA是屬于目前科學研究的前沿領(lǐng)域之一，在本科生物實驗教學中開展miRNA的表達檢測實驗，將本科實驗教學與科學研究結(jié)合起來，更有助于培養(yǎng)學生的科學思維能力，拓展學生對有關(guān)前沿科學研究的認識，激發(fā)學生對生物實驗課程和科學研究的興趣。

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Exploration on experiment of detection of microRNA by liquid Northern hybridization in molecular biology experimental teaching

LI Fosheng, WANG Hong, LI Yifan, WANG Tian, FAN Jia, WANG Maolin, LIN Honghui

(Experimental Teaching Center of Biological Sciences, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

In order to enrich the experimental teaching content of molecular biology and deepen students’ understanding of the theoretical knowledge of molecular hybridization, the liquid-phase Northern hybridization for detection of microRNA is carried out in the experimental teaching of molecular biology. Fluorescent labeled oligonucleotides are used as probes to explore different hybridization conditions such as probe sensitivity, hybridization temperature, hybridization time and hybridization solution, so as to detect microRNA in different plants simply, accurately and sensitively. The whole experimental process only takes a few hours to complete, and the experimental results are intuitive and vivid.

molecular biology; experimental teaching; liquid Northern hybridization; molecular detection; microRNA

G642.423

A

1002-4956(2019)07-0225-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.07.055

2018-12-24

四川大學2017年實驗技術(shù)立項資助項目（20170050）

李佛生（1987—），男，江西贛州，博士，實驗師，主要從事生物學實驗的教學和科研工作.E-mail: foshengli1987@163.com

林宏輝（1968—），男，四川仁壽，博士，教授，博士生導師，主要從事植物逆境分子生物學及植物代謝工程方面研究.E-mail: hhlin@scu.edu.cn