杜 瑾,張曉青,張愛君,司曉光,王樹勛,曹軍瑞*
(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所,天津 300192)
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一種有機四價硫形式甲硫氨酸磺酰基化合物,廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),參與40多種生化反應,在轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫基中起重要作用,被稱為“活性甲硫氨酸”[1]。臨床上廣泛用于肝炎、關節(jié)炎、抑郁癥和各種肝病的治療[2-3],在食品添加劑領域也有著巨大的市場需求。微生物發(fā)酵技術制備SAM具有成本低廉、易于操作等優(yōu)點,是目前SAM工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法[4],采用的微生物主要為釀酒酵母[5]、畢赤酵母[6]等酵母菌。
酵母菌積累SAM的能力較強,但由于SAM是胞內(nèi)產(chǎn)物,在分離純化過程中首先要破碎較厚的酵母細胞壁,最大限度地提取SAM產(chǎn)物。文獻中報道較多的破碎酵母釋放SAM方法主要是化學試劑法,其中應用最廣的萃取劑為高氯酸和乙酸乙酯-硫酸[7-8]。高氯酸法的萃取效果近似達到100%,是早期提取SAM的主要方法,但高氯酸的危險性較高,目前僅用作萃取標準[9]。乙酸乙酯-硫酸法萃取率可達到90%,但有機溶劑用量大,提取成本和污染性均較高。近年來,開發(fā)安全、高效、環(huán)保的SAM提取工藝受到關注。如已有研究采用硫酸溶液在70 ℃熱水條件[10]和4 ℃冷水條件[11]提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM。李繼安等[12]采用無機強酸水溶液并凍融處理提取SAM。李勇等[13]采用高壓氮氣擠壓式細胞破碎法破碎酵母細胞釋放胞內(nèi)SAM。
超聲波可通過水介質(zhì)的空化作用,使細胞壁結構破碎,釋放內(nèi)容物,在較短的提取時間內(nèi)提高提取效率,具有設備需求低、操作簡便、安全性好等優(yōu)點,常用于食品工業(yè)中產(chǎn)物提取過程的強化和優(yōu)化[14-15],可用于提取酵母細胞內(nèi)活性物質(zhì)[16-17]。本研究創(chuàng)新采用低濃度鹽酸溶液作為提取液,輔以超聲破碎酵母細胞,通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應面試驗優(yōu)化釀酒酵母胞內(nèi)SAM提取的最佳工藝條件,為實現(xiàn)SAM的高效、環(huán)保制備提供參考。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌體由自然資源部第三海洋研究所提供。
SAM標準品 美國Sigma公司;甲醇、甲酸銨(均為色譜純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
ZHWY-2102C型恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;3K15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司;SFX550型超聲波破碎儀 美國Branson公司;ACQUITY型超高效液相色譜儀 美國Waters公司。
1.3.1 SAM含量測定
采用超高效液相色譜測定SAM,檢測方法參考文獻[18]。色譜柱為BECH C18反相柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動相0.01 mol/L甲酸銨,pH 3~4;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃。二極管陣列檢測器的檢測波長為254 nm。SAM標準品及分析樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。
1.3.2 SAM提取量和提取率的計算
SAM提取量的計算如式(1)所示:
式中:C為根據(jù)標準曲線方程計算出測量液中SAM的質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為提取液體積/mL;N為稀釋倍數(shù);W為釀酒酵母菌體干質(zhì)量/g。
SAM提取率的計算如式(2)所示:
式中:X為SAM提取量/(mg/g);X0為采用高氯酸法提取SAM的提取量/(mg/g)。
1.3.3 SAM提取液的篩選
準確稱取0.2 g酵母干細胞,加入6 mL不同提取液,分別為1.5 mol/L高氯酸、1.5 mol/L鹽酸、0.1 mol/L鹽酸、0.01 mol/L鹽酸、0.001 mol/L鹽酸,常溫振蕩處理4 h;或加入2 mL乙酸乙酯-水溶液(體積比1∶1)振蕩提取1 h后,再加入4 mL 0.4 mol/L硫酸溶液振蕩提取3 h。4 ℃、8 000 r/min離心15 min,去除破碎菌體,收集上清液,用于SAM含量測定。以SAM提取量和提取率為指標,綜合考慮有機溶劑用量、SAM穩(wěn)定性等因素,選擇合適的提取液。
1.3.4 超聲輔助提取的單因素試驗
以0.1 mol/L鹽酸為提取液,固定超聲輔助提取的基本參數(shù)為超聲功率250 W、超聲時間(指總的超聲工作時間,下同)5 min、超聲時間間隔10∶10 (工作時間∶間歇時間,s/s)、料液比1∶30 (g/mL)。在基本超聲參數(shù)下,分別考察超聲功率(100、150、200、250、300、350、400 W)、超聲時間(1、2、3、4、5、6、7 min)、時間間隔(10∶3、10∶5、10∶8、10∶10、8∶10、5∶10、3∶10(s/s))、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL))4 個因素對SAM提取量的影響。
1.3.5 Plackett-Burman試驗
選擇超聲功率、超聲時間、時間間隔、料液比4 個因素進行Plackett-Burman試驗設計,考察SAM提取量,篩選出影響SAM提取量的重要因素。試驗各因素與水平設計見表1。
表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Experimental factors and levels used in Plackett-Burman design
1.3.6 最陡爬坡試驗
根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出的顯著影響因素的正負效應,設計最陡爬坡試驗的爬坡方向和步長,使SAM提取量逼近最佳值反應區(qū)域[19]。
1.3.7 超聲輔助提取SAM工藝條件的響應面優(yōu)化試驗
在Plackett-Burman試驗及最陡爬坡試驗基礎上,采用Box-Behnken方法設計3因素3水平的響應面分析試驗,對SAM提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。試驗各因素編碼和水平設置見表2。
表2 Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design
每組3 次平行實驗,結果取平均值。采用Office Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)制圖。Design-Expert 8.06軟件進行響應面設計及結果分析。
傳統(tǒng)工藝一般采用1.5 mol/L高氯酸或乙酸乙酯-硫酸提取酵母菌體胞內(nèi)SAM。按照1.3.3節(jié)方法,選取不同提取液以及不同濃度的鹽酸溶液,提取效果如表3所示。
由表3可知,1.5 mol/L高氯酸提取量最高,文獻中通常作為SAM提取量100%計算。乙酸乙酯提取率達91.3%,與文獻[7]報道一致。為降低操作危險性和對環(huán)境污染,本研究采用不同濃度鹽酸提取釀酒酵母菌體中SAM,以期采用低濃度鹽酸提取胞內(nèi)SAM。結果顯示,SAM提取量隨鹽酸濃度降低而降低。當鹽酸濃度降低至0.01 mol/L時,提取率可達到65.7%;但當鹽酸濃度降低至0.001 mol/L時,提取率降低至32.9%。同時,由于SAM在酸性條件下穩(wěn)定,而鹽酸濃度低于0.01 mol/L時,溶液pH值高于2,不利于SAM穩(wěn)定性。因此,選取0.01 mol/L鹽酸為提取液,進行下一步實驗。
表3 不同提取液對SAM提取效果的影響Table 3 Effect of different solvents on the extraction yield of SAM
2.2.1 超聲功率對SAM提取量的影響
圖1 超聲功率對釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae
由圖1可知,釀酒酵母中SAM提取量首先隨超聲功率的增大而增加,當超聲功率為300 W時達到最大,而后逐漸下降。這是由于超聲功率越大,超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的空化效應和機械作用的強度越大,其破碎酵母細胞壁的效果越好[20],越有利于釋放胞內(nèi)SAM。但過高的超聲功率會使SAM分子結構變化或降解,也會使更多的胞內(nèi)雜質(zhì)溶入提取液中,影響SAM提取量,增加后續(xù)分離純化工藝的難度。因此,選擇超聲功率為300 W。
2.2.2 超聲時間對SAM提取量的影響
圖2 超聲時間對釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae
由圖2可知,在超聲時間1~3 min范圍內(nèi),SAM提取量隨超聲時間延長而增加,當超聲時間為3 min時達到最大,而后SAM提取量趨于平緩,至7 min時明顯下降。這是由于超聲波對細胞壁的破壞能夠隨時間延長而更加充分,使胞內(nèi)SAM完全釋放,但過長的超聲時間會造成天然活性產(chǎn)物降解[21]。因此,選擇超聲時間為3 min。
2.2.3 超聲時間間隔對SAM提取量的影響
圖3 超聲時間間隔對釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 3 Effects of ultrasonic irradiation interval on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae
如圖3所示,超聲時間間隔10∶3~10∶10時,SAM提取量隨間歇時間的延長而增加,而后隨著時間間隔比值的減小,SAM提取量基本持平。這是由于超聲波破壞酵母細胞壁的過程中伴隨著熱量積聚[22],間歇時間過短不利于熱量擴散,且SAM具有熱不穩(wěn)定性,造成SAM降解、提取量降低。而當總工作時間一定時,胞內(nèi)SAM已充分釋放,即使增加間歇時間也不能提高SAM提取量,反而會增加SAM提取過程的總耗時。因此,選擇超聲時間間隔為10∶10(s/s)。
2.2.4 料液比對SAM提取量的影響
圖4 料液比對釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 4 Effects of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae
由圖4可知,在料液比1∶10~1∶25(g/mL)范圍內(nèi),由于細胞內(nèi)與溶劑間溶質(zhì)濃度差隨提取劑體積的增加而增大,傳質(zhì)推動力提高[23],SAM提取量隨之增大。但在料液比達到1∶25(g/mL)之后,SAM已被充分提取,進一步增加提取劑用量,SAM提取量仍基本持平。綜合考慮提取效果和提取劑成本,選擇料液比為1∶25(g/mL)。
以影響SAM提取量的超聲條件作為4 個因素,選用N為12進行Plackett-Burman試驗設計,X1、X3、X5、X7分別代表超聲功率、超聲時間、時間間隔、料液比,設計X2、X4、X6、X8、X9、X10空白作為誤差分析項。每個因素分別選取了高(1)和低(-1)兩個水平,以SAM產(chǎn)量作為響應值。Plackett-Burman試驗設計和響應值見表4,每個試驗設2 個平行樣,結果取平均值。
表4 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 4 Plackett-Burman design with response variable
使用Design-Expert 8.06軟件對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析,影響SAM產(chǎn)量因素主效應分析結果見表5?;貧w模型的主效應P小于0.000 1,說明Plackett-Burman試驗設計因素在所選取的水平范圍內(nèi)對SAM提取量的影響顯著。從SAM提取量響應值方面分析,時間間隔(X5,P=0.244 4)對SAM提取量影響不顯著(P>0.05)。料液比(X7,P<0.000 1)、超聲功率(X1,P=0.000 7)、超聲時間(X3,P=0.019 4)對SAM提取量影響顯著(P<0.05),其影響順序為料液比>超聲功率>超聲時間。因此,選取該3 個因素進行最陡爬坡試驗,進一步逼近其最佳區(qū)域。
表5 SAM提取量影響因素主效應分析Table 5 Main effect analysis of the extraction yield of SAM versus various factors
由Plackett-Burman試驗回歸方程中確定的3 個重要因素的變量確定試驗范圍和爬坡步長,設計最陡爬坡路徑[24],試驗設計及結果見表6。可以看出,SAM提取量變化趨勢為先上升再趨于平穩(wěn),在第4組試驗中SAM提取量達到最大(55.45 mg/g)。因此,選擇第4組試驗的各因素取值作為響應面試驗的中心點,即超聲功率300 W、超聲時間4 min、料液比1∶25(g/mL)。
表6 最陡爬坡試驗設計及結果Table 6 Steepest ascent design with experimental results
2.5.1 Box-Behnken試驗結果
根據(jù)Plackett-Burman試驗及最陡爬坡試驗結果,采用Box-Behnken設計,以超聲功率(X1)、超聲時間(X3)、料液比(X7)為因變量共設計17 組試驗,試驗設計方案及結果見表7。
表7 Box-Behnken試驗設計及結果Table 7 Box-Behnken design with experimental results
利用Design-Expert 8.06軟件對表7試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到以SAM提取量為響應值的回歸方程為:
對回歸模型作顯著檢驗和方差分析,結果見表8。該模型的P值小于0.001,失擬項P值為0.094 4(>0.05),表明該模型失擬不顯著,但回歸極顯著。該模型R2為0.968 4,調(diào)整后R2為0.927 7,表明該模型能夠解釋92.77%關鍵因素對釀酒酵母菌體中SAM提取量的影響,可以用其確定最佳提取工藝條件。
表8 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 8 Analysis of variance of quadratic polynomial model
從表8可知,回歸方程一次項X3對SAM提取量的影響達到顯著水平(P<0.05),X1、X7達到極顯著水平(P<0.01),3 個因素對SAM提取量的影響順序為:料液比(X7)>超聲功率(X1)>超聲時間(X3)。二次項為極顯著。
2.5.2 響應面分析
響應面圖是回歸方程的形象描述,能夠直觀反映各個因素與響應值之間的關系以及兩因素間交互作用的類型[25-27]。三因素的兩兩交互作用體現(xiàn)在相應曲面圖中時,曲面呈馬鞍型且等高線呈橢圓形表示兩因素交互影響顯著,而曲面呈圓滑型且等高線呈圓形則表示兩因素之間交互作用不顯著[28-29]。超聲輔助低濃度鹽酸提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM的工藝條件中,各因素交互作用的響應面及等高線見圖5。
從圖5可以看出,影響釀酒酵母胞內(nèi)SAM提取量的3 個因素(超聲功率、超聲時間、料液比)兩兩因素交互作用的響應面圖都較平緩,等高線圖的橢圓形都較不明顯,接近圓形,表明超聲功率與超聲時間、超聲時間與料液比、超聲功率與料液比之間有一定的交互作用,但交互效應均較弱。結合表8結果,交互項X1X3、X1X7、X3X7對試驗結果的顯著性分析均為P>0.05,表明超聲功率、超聲時間和料液比這3 個因素的兩兩交互作用不顯著,與圖5中響應面和等高線圖所示結果一致。
上述回歸模型的最佳值存在響應面最高點,等高線圖的圓心,即SAM提取量最大時的穩(wěn)定點,與之對應的因素水平即為最佳工藝條件[30]。通過Design-Expert 8.06軟件計算得出,提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM的最佳條件為超聲功率314 W、超聲時間4.11 min、料液比1∶27(g/mL),在此優(yōu)化條件下,SAM提取量的理論值為65.92 mg/g。
2.5.3 驗證實驗
鑒于實際操作的可行性,將SAM提取條件修正為超聲功率314 W、超聲時間4.1 min、料液比1∶27(g/mL),平行實驗3 次,得到的SAM提取量為66.56 mg/g,與預測值相差0.98%,說明用該模型所獲得的優(yōu)化提取條件可靠。此時,以高氯酸法提取率為100%所計算的SAM提取率為92.1%。
本研究比較了高氯酸、乙酸乙酯-硫酸和不同濃度鹽酸對釀酒酵母菌胞內(nèi)SAM提取量和提取率的影響,選取0.01 mol/L鹽酸為提取液。在單因素試驗的基礎上,通過Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗得出了關鍵影響因素及水平,最后利用Box-Behnken法設計響應面試驗獲得最優(yōu)工藝條件為超聲功率314 W、超聲時間4.1 min、料液比1∶27(g/mL),此時SAM提取量為66.56 mg/g,SAM提取率可達92.1%。此方法以較低濃度鹽酸為提取液并輔以超聲波破碎細胞壁,與傳統(tǒng)的高氯酸法和乙酸乙酯-硫酸法相比,有機溶劑用量少、安全性較高,有利于SAM的進一步研究和產(chǎn)品開發(fā)。