黃 珊,王修俊*,劉佳慧,沈暢萱
(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所,貴州 貴陽 550006;3.貴州大學(xué) 發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室,貴州 貴陽 550025)
三穗鴨原產(chǎn)于貴州省東部低丘陵河谷地帶,由野鴨馴養(yǎng)而成,主要分布在貴州三穗縣及周邊各縣、市,具有肉質(zhì)細嫩味鮮香、產(chǎn)蛋率高、低膽固醇等特點,與高郵麻鴨、北京鴨、紹興鴨同被譽為中國四大地方名鴨[1],深受消費者的喜愛[1-2]。但鴨骨架作為不可食用的部分沒有得到充分利用,常常被丟棄或加工成低附加值的產(chǎn)品,造成資源的浪費和環(huán)境的嚴重污染。將鴨骨粉碎,經(jīng)提取、濃縮等處理不僅能得到富含蛋白質(zhì)、鈣、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的一種天然調(diào)味料,還提高了鴨骨的利用率,但肉香味不明顯。目前美拉德反應(yīng)是肉類產(chǎn)生香味[3-4]、色澤[5-7]變化的重要途徑之一,它打破了傳統(tǒng)的香料調(diào)配,且形成的肉類香料具有天然肉類香料的逼真口感和風味,是調(diào)配技術(shù)無法比擬的。目前,工廠為制備香氣濃郁的肉味香料,主要利用豬骨素、雞骨素和牛骨素或肉酶解[8]等方法,將蛋白質(zhì)水解成分子質(zhì)量較小的肽類物質(zhì)或氨基酸,并添加還原糖[9]、硫胺素[10]等輔料后進行美拉德反應(yīng)。孫紅梅等[10-11]對雞骨素以及鴨骨架的美拉德反應(yīng)條件進行了研究,并對其風味成分進行了測定。但以三穗鴨鴨骨酶解液為原料制備肉味香料卻鮮有報道。
對食品風味口感的評定主要有儀器分析和感官評價[10-12],但目前為止國內(nèi)外尚無一種可靠的儀器能夠完全代替人類的感覺器官對食品感官評定所起的作用。沿用傳統(tǒng)的感官分析方法易受到人員因素的主觀影響,使得數(shù)據(jù)缺乏可靠性,導(dǎo)致評價結(jié)果存在一定的偏差和模糊性,將模糊數(shù)學(xué)概念運用于感官評價中并建立綜合評判法會使結(jié)果更加客觀、可靠和科學(xué),有研究表明,改良的模糊綜合評判法[13-15]更具有優(yōu)勢、更可靠,且在食品感官分析中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。
本研究以貴州三穗鴨鴨骨經(jīng)超聲波-木瓜蛋白酶酶解得到的鴨骨酶解液為原料,考察不同pH值、溫度、時間對美拉德反應(yīng)的影響,以褐變度、低分子香味中間體形成程度和感官評分作為評價指標,采用正交試驗優(yōu)化鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)工藝,并且將改良的模糊綜合評判法運用到優(yōu)化鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)制備肉味香料中,并利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)儀檢測鴨骨酶解液以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的揮發(fā)性風味物質(zhì),分析制作肉味香料過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)與感官品質(zhì)之間存在的關(guān)系,以期為提高貴州三穗鴨鴨骨的利用率和制備肉味香料提供技術(shù)參考和依據(jù)。
三穗鴨鴨骨(蛋白質(zhì)含量為11.04 g/100 g):貴州三穗翼宇鴨業(yè)有限公司。
木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、半胱氨酸鹽酸鹽(分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;葡萄糖(分析純)、木糖(分析純):成都金山化學(xué)試劑有限公司。
PHS-3C型pH計:上海鴻蓋儀器有限公司;721型分光光度計:上海佑科儀表儀器有限公司;SH220型石墨消解儀:濟南海能儀器有限公司;TGL20M-II型高速冷凍離心機:湖南凱達科學(xué)儀器有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋:青島海洋化工有限公司;XFS-280A型手提式壓力蒸汽滅菌鍋:浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:日本島津公司;DB-5MS色譜柱、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭:美國Supelco公司。
1.3.1 鴨骨酶解液的制備[16-17]
貴州三穗鴨鴨骨經(jīng)超聲波-木瓜蛋白酶酶解(酶解溫度61℃,超聲功率247 W,超聲時間5 h,酶添加量1.354%)后于95℃水浴鍋中滅酶15 min,在3 500 r/min條件下離心15 min后去除沉淀,得到鴨骨酶解液。經(jīng)測定其蛋白質(zhì)含量為19.8 g/100 g。
1.3.2 鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)工藝
在查閱相關(guān)文獻研究的基礎(chǔ)上結(jié)合前期試驗,建立了相應(yīng)的鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)制備肉味香料的體系。取250 mL鴨骨酶解液,加入2.5%的還原糖(木糖∶葡萄糖=1∶3),3.0%的半胱氨酸鹽酸鹽和3%的硫胺素后,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值,在不同的pH值條件下進行美拉德反應(yīng),最后通過噴霧干燥將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物加工成固體調(diào)味料。
1.3.3 指標測定
美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度的測定[18-19]:將美拉德反應(yīng)液稀釋50倍,以蒸餾水為參比,使用分光光度計在波長420nm處測定其吸光度值(A420nm)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度是美拉德反應(yīng)的重要指標,隨著美拉德反應(yīng)的進行,反應(yīng)產(chǎn)物顏色和色澤越來越深,在波長420 nm處吸光度值可反映反應(yīng)產(chǎn)物聚合程度,選擇反應(yīng)產(chǎn)物顏色為淡黃褐色,有明顯光澤時為最佳褐變程度。
美拉德反應(yīng)產(chǎn)物低分子質(zhì)量香味中間體形成程度的測定[18-20]:將美拉德反應(yīng)液稀釋50倍,以蒸餾水為參比,使用分光光度計在波長280 nm處測定其吸光度值(A280nm),其吸光度值越大,表明反應(yīng)后香味物質(zhì)越多,反之則越少。
1.3.4 鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化單因素試驗
反應(yīng)pH值的影響:以美拉德反應(yīng)液的褐變度、低分子香味中間體形成程度和感官評分作為評價指標,控制反應(yīng)溫度為110℃,反應(yīng)時間為30 min,考察不同反應(yīng)pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響。
反應(yīng)溫度的影響:以美拉德反應(yīng)液的褐變度、低分子香味中間體形成程度和感官評分作為評價指標,控制反應(yīng)pH值為7.0,反應(yīng)時間為30 min,考察不同反應(yīng)溫度(100℃、105℃、110℃、115℃、120℃)對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響。
反應(yīng)時間的影響:以美拉德反應(yīng)液的褐變度、低分子香味中間體形成程度和感官評分作為評價指標,控制反應(yīng)pH值為7.0,反應(yīng)溫度為110℃,考察不同反應(yīng)時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響。
1.3.5 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以低分子香味中間體形成程度和感官評分為指標,采用L9(34)正交試驗優(yōu)化鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)制備肉味香料的工藝條件。每組試驗結(jié)束后將樣品稀釋10倍后進行感官評定。因素與水平見表1。
表1 鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for Maillard reactionconditions optimization of duck bone enzymatic hydrolysate
1.3.6感官評定方法
選取10名從事食品研究且具有一定感官評價經(jīng)驗的人組成評價小組,將待評價的樣品統(tǒng)一稀釋10倍后盛入相同大小的帶密封蓋的透明玻璃瓶中,保證各瓶中樣品高度一致,以隨機出現(xiàn)的方式進行評定。試驗中要求評價小組成員評價前12 h不喝酒、吸煙,不吃辛辣刺激食品[10-11],評定過程中禁止評價小組成員相互討論,開始下一個樣品評定之前,間隔5 min并以溫水漱口。
(1)評定論域、評語集的建立
試驗以色澤、香氣、滋味及組織形態(tài)這4項作為感官評價指標,其構(gòu)成了因素集,即U=(色澤 u1,香氣 u2,滋味u3,組織形態(tài)u4);以極好、好、一般、差、極差為評定語,即評語集為C=(極好c1,好c2,一般c3,差c4,極差c5),評分標準參考見表2[15]。
表2 鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of duck bone enzymatic hydrolysates Maillard reaction
(2)指標權(quán)重集的確定
權(quán)重是表示某個特定指標在整個評價過程中的相對重要程度及影響力。采用模糊數(shù)學(xué)法進行食品感官質(zhì)量評判時,權(quán)重分配方案的合理與否直接影響到評價結(jié)果的正確性[21-23],所有評價指標的權(quán)重構(gòu)成了權(quán)重集,即A=(A1,A2,A3,...,An),且和為1。本試驗采用強制決定法確定鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物各感官指標權(quán)重因子A={0.4,0.4,0.1,0.1}[15,23]。
(3)模糊矩陣的建立及模糊線性轉(zhuǎn)換
采用模糊數(shù)學(xué)的方法處理香料的評定結(jié)果,根據(jù)模糊矩陣變換原理,將權(quán)重集A與模糊關(guān)系矩陣R合成,即Y=A×R[10]。但一般的模糊綜合評判法還存有缺陷,使得評價結(jié)果與實際情況有很大出入[15,24],采用改進的模糊綜合評判法即引用綜合評分公式處理模糊綜合評判結(jié)果向量,對肉味香料的感官質(zhì)量進行評價、分析。綜合評分公式如下:
式中:i為第i個因素;j為i因素對應(yīng)的評價分值。
通過計算得到每個樣品的綜合評分(H值),比較H值與評語對應(yīng)評價分值接近程度或按照H值大小進行排序,對各樣品進行評定。
1.3.7 揮發(fā)性風味物質(zhì)的SPME-GC-MS檢測分析[25]
風味成分的提?。悍謩e取鴨骨素提取液1mL、美拉德反應(yīng)液1 mL,置于10 mL采樣瓶中,插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在90℃條件下萃取30 min,快速移出萃取頭并立即插入進樣口,280℃條件下熱解吸2 min后進樣。
氣相色譜條件:色譜柱為DB-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),采用程序升溫,起始柱溫40℃,保持3 min,以5℃/min升溫至240℃,保持42 min;進樣口溫度280℃;載氣為高純氦氣(He)(99.999%);載氣流速1.0 mL/min;采用不分流進樣。
質(zhì)譜條件:電子電離(electron ionization,EI)源;離子源溫度200℃,四極桿溫度150℃,電子能量70 eV;質(zhì)量范圍20~500 amu;檢測電壓1.2 kV;采用全掃描模式。
定性定量方法:通過系統(tǒng)全掃描模式得到揮發(fā)性成分的總離子流圖,經(jīng)計算機把各峰與標準譜庫(Wiley,Replib,Nist,Manilib)進行比較及分析,相似指數(shù)(similarity index,SI)在800以上作為揮發(fā)性風味成分的定性結(jié)果,采用峰面積歸一化法計算揮發(fā)性風味成分的相對含量。
1.3.8 數(shù)據(jù)分析
采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)和分析差異顯著性(P<0.05),并用Origin 9.0 軟件作圖。
2.1.1 反應(yīng)pH值對鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響
控制反應(yīng)溫度為110℃,反應(yīng)時間為30 min,測得不同反應(yīng)pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度及低分子質(zhì)量香味中間體的影響如圖1所示,感官評定如圖2所示。
圖1 反應(yīng)pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變及低分子香味中間體的影響Fig.1 Effects of reaction pH on Maillard reaction product browning and low molecular flavor intermediates
由圖1可知,隨著反應(yīng)pH值的增加,反應(yīng)產(chǎn)物在波長420 nm處的吸光度值逐漸增加,其褐變程度逐漸增加,而波長280 nm處的吸光度值在pH值4~7之間先增加,而后再減小,反映出低分子質(zhì)量香味中間體先增多而后再減少,pH值為7時最適合香味的小分子物質(zhì)的形成。這是由于在低pH值條件下,氨基以質(zhì)子化形式存在,阻礙了與還原糖的羰氨縮合[26],不利于美拉德反應(yīng),從而得不到大量的芳香類物質(zhì),反之,pH值過高會使得反應(yīng)越強烈、速度越快,褐變嚴重、產(chǎn)生明顯的焦糊味等不利氣味,同時香味的小分子物質(zhì)在反應(yīng)中不斷環(huán)化形成不具有香味的大分子物質(zhì),破壞產(chǎn)物的風味[5]。在不同反應(yīng)pH值條件下,反應(yīng)產(chǎn)物在波長420nm與280nm處吸光度值皆有顯著性差異(P<0.05)。由圖2可知,當pH值為5、6時,產(chǎn)物的綜合感官評分基本沒有變化,pH值為7.0時,感官評分最好,之后隨著pH的增加而降低。因此,綜合考慮褐變程度、低分子質(zhì)量香味中間體的積累量以及綜合感官評價,選擇最佳反應(yīng)pH值為7.0。
圖2 反應(yīng)pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評價的影響Fig.2 Effects of reaction pH on sensory evaluation of Maillard reaction products
2.1.2 反應(yīng)溫度對鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響
控制反應(yīng)pH值為7.0,反應(yīng)時間為30 min,測得不同反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度及低分子質(zhì)量香味中間體的影響如圖3所示,感官評定如圖4所示。
圖3 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變及低分子香味中間體的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on Maillard reaction product browning and low molecular flavor intermediates
由圖3可知,在100~120℃條件下,隨著反應(yīng)溫度的升高,A420nm值越大,反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度越深,A280nm呈先上升后下降的趨勢,在110℃時,低分子質(zhì)量香味中間體積累量最多,在不同反應(yīng)溫度條件下,反應(yīng)產(chǎn)物在波長420 nm與280nm處吸光度值皆有顯著性差異(P<0.05)。在80~120℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高反應(yīng)越強烈,褐變速率越快,導(dǎo)致累積的類黑素越多。不同的反應(yīng)溫度促使美拉德反應(yīng)沿著不同的反應(yīng)支路進行,從而導(dǎo)致中間產(chǎn)物以及最終產(chǎn)物有很大的區(qū)別[12,27],使得不同反應(yīng)溫度條件下A420nm和A280nm值呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。由圖4可知,在110℃時感官評分最好,溫度過高過低都會影響產(chǎn)品的綜合評分,有研究表明,美拉德反應(yīng)中香氣物質(zhì)主要是在較高溫度條件下形成的[28]。當反應(yīng)溫度較低時,反應(yīng)程度不夠,主要產(chǎn)物是醛類、呋喃類等化合物,香氣不夠濃郁飽滿,反之溫度過高,反應(yīng)劇烈,樣品色澤深且雜味物質(zhì)增多,焦糊味重且降低其營養(yǎng)價值。綜合考慮選擇最佳反應(yīng)溫度為110℃。
圖4 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評價的影響Fig.4 Effects of reaction temperature on sensory evaluation of Maillard reaction products
2.1.3 反應(yīng)時間對鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)的影響
控制反應(yīng)溫度為110℃,反應(yīng)pH值為7.0,測得不同反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度及低分子質(zhì)量香味中間體的影響如圖5所示,感官評定如圖6所示。
圖5 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變及低分子香味中間體的影響Fig.5 Effects of reaction time on Maillard reaction product browning and low molecular flavor intermediates
由圖5可知,隨著反應(yīng)時間的延長,反應(yīng)產(chǎn)物A420nm值越大且增加趨勢是先快后慢,主要是隨著反應(yīng)的進行,反應(yīng)底物不斷被消耗,類黑素物質(zhì)先快速增多后趨于平緩,美拉德反應(yīng)趨于反應(yīng)完全。A280nm呈先上升后下降的趨勢,在30min時最大,在不同反應(yīng)時間條件下,反應(yīng)產(chǎn)物在波長420nm與280nm處吸光度值皆有顯著性差異(P<0.05)。
圖6 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評價的影響Fig.6 Effects of reaction time on sensory evaluation of Maillard reaction products
由圖6可知,感官評分隨著反應(yīng)時間的增加先增高再減低,在30 min時感官評分最高,當反應(yīng)時間<30 min之前,美拉德反應(yīng)不夠充分,生成的呈香物質(zhì)不夠,香氣不夠濃郁,反之,反應(yīng)時間過長,產(chǎn)物顏色太深且產(chǎn)生的類黑素物質(zhì)不斷環(huán)化生成吡啶、吡咯、含硫化合物等雜環(huán)化合物[5,29],使得糊味和硫味濃烈,掩蓋了肉香味及烤香味,降低了感官評分。因此,綜合考慮選擇適宜反應(yīng)時間為30 min。
2.2.1 模糊感官評定結(jié)果
評定小組成員對正交試驗中制備的肉味香料樣品的色澤、香氣、滋味及組織形態(tài)進行評價,結(jié)果見表3。
將表3中9個肉味香料樣品的各自4個評價因素的各等級所得票數(shù)除以總評價人數(shù),得到模糊評判矩陣R。以試驗序號為1的樣品為例,建立色澤(u1)、香氣(u2)、滋味(u3)及組織形態(tài)(u4)4個評價因素的模糊評價矩陣:u1=[0.1 0.2 0.6 0.1 0.0],u2=[0.1 0.3 0.5 0.1 0.0],u3=[0.0 0.2 0.5 0.3 0.0],u4=[0.0 0.3 0.5 0.2 0.0],它們構(gòu)成了試驗序號為1的樣品的模糊評價矩陣R1,根據(jù)Y=A×R,可得到其他組樣品的模糊評價結(jié)果。根據(jù)綜合評分公式計算得到各樣品的綜合感官評定值,其中i表示樣品編號,結(jié)果見表4。
表3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價票數(shù)分布Table 3 Vote distribution of sensory evaluation of Maillard reaction products
表4 各樣品的綜合評定結(jié)果Table 4 Comprehensive sensory evaluation of all samples
由表4可知,第2組樣品的綜合評分最低,且A280nm值最低。第1、3、6、7、8組樣品的綜合評分介于y3和y4之間更接近于y3,綜合品質(zhì)在好與一般中更偏向于一般,第5和9組樣品綜合評分比較相近且在y3和y4之間更接近于y4,表明它們的綜合品質(zhì)在好和一般中更接近于好,第4組樣品綜合評分最高,排名第一,A280nm值為0.214±0.019最高。因此第4組制備的肉味香料最好。最佳工藝條件為:在添加2.5%的還原糖(木糖∶葡萄糖=1∶3),3.0%的半胱氨酸鹽酸鹽和3%的硫胺素的基礎(chǔ)上,控制反應(yīng)pH值為7.0,反應(yīng)溫度為105℃、反應(yīng)時間為30 min。
采用SPME-GC-MS對鴨骨酶解液和對優(yōu)化后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行分析檢測。鴨骨酶解液和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜圖見圖7,揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果見表5。
圖7 鴨骨酶解液(A)以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(B)中揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.7 Total ion chromatogram of volatile compounds of duck bone enzymatic hydrolysate(A)and Maillard reaction product(B)analysis by GC-MS
表5 揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis results of volatile components
續(xù)表
由表5可知,鴨骨酶解液中檢測出26種揮發(fā)性成分,主要是醛、酮、酯、呋喃、烴類、呋喃類化合物,有研究表明,酯類可以提高并改善肉香味,呋喃類化合物不僅本身具有一定奶油香、焦糖香,還對肉香味起到一定的修飾作用,還會生成如2-甲基-3-呋喃硫醇等肉香味物質(zhì)的重要中間產(chǎn)物[30]。鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測出揮發(fā)性成分共有49種,其中醛酮類15種、烷烴類10種、酸類7種、酯類5種、醇類3種、呋喃類3種、含硫化合物3種、芳香族2種、噻唑類1種。經(jīng)美拉德反應(yīng)制成的肉味調(diào)味料,揮發(fā)性風味成分種類明顯增加,且生成了噻唑類、呋喃類、含硫化合物等肉類產(chǎn)品的特征風味物質(zhì)(如烤香味、脂肪味等)[31]。它們相互作用使鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)制備的肉味香料香氣濃郁、口感醇厚。
本試驗以貴州三穗鴨鴨骨酶解液為原料,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用正交試驗并結(jié)合改良的模糊綜合評判法對美拉德反應(yīng)進行優(yōu)化,得到鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)制備肉味香料的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)pH值7.0,反應(yīng)溫度105℃,反應(yīng)時間30min。在此優(yōu)化條件下得到的肉味香料色澤好、口感醇厚,回味鮮香綿長,肉香味濃郁且沒有不良氣味。采用SPME-GC-MS對揮發(fā)性風味物質(zhì)進行檢測和分析,鴨骨酶解液中檢測出26種揮發(fā)性成分,主要生成了醛、酯、烴、呋喃、酸類,鴨骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測出揮發(fā)性成分共有49種,揮發(fā)性物質(zhì)種類明顯比鴨骨酶解液中豐富,且生成了噻唑類、呋喃類、芳香族以及含硫化合物等肉類產(chǎn)品的特征風味物質(zhì),這些風味物質(zhì)相互作用使制備的肉類香料香氣濃郁、回味鮮香綿長。本研究為貴州三穗鴨鴨骨的深加工利用提供參考,同時為新型肉味香料的生產(chǎn)開拓了新領(lǐng)域,具有廣闊的市場前景。