張櫪心

(湖南省兒童醫(yī)院眼科 長沙 410006)

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)是一種發(fā)生在視網(wǎng)膜的病態(tài)血管增生，它的發(fā)生與多種疾病相關(guān)聯(lián)，包括視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和年齡相關(guān)性黃斑變性[1-2]。有證據(jù)[3-4]表明，缺血、缺氧是導(dǎo)致RNV的主要原因，但潛在的機制還不明確。RNV是一個多步驟的復(fù)雜過程，涉及各種血管生成因素的復(fù)雜相互作用，包括血管生成因子、炎性細胞因子、趨化因子和生長因子等；另外，細胞外基質(zhì)的變化也會影響RNV[5]。系統(tǒng)地研究缺血、缺氧導(dǎo)致RNV的分子機制，將有助于尋找有效治療RNV的手段。

microRNA(miRNAs,miR)是一類長度為17～25個核苷酸的短鏈非編碼RNA。miRNAs通過結(jié)合到mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)來調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和(或)翻譯，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達[6]。miRNAs與RNV的關(guān)聯(lián)在近期的一些文獻中可見報道，例如Yang等[7]報道m(xù)iR-181a通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達抑制了小鼠模型中RNV；在人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells, HRMEC)中，miR-200b/c通過下調(diào)VASH2抑制了HRMEC的增殖和遷移，因此推測miR-200b/c有可能抑制血管生成[8]；Wang等[9]發(fā)現(xiàn)miR-370通過抑制KDR基因的表達而抑制視網(wǎng)膜毛細內(nèi)皮細胞的生長和誘導(dǎo)凋亡，預(yù)示其可能在治療RNV中發(fā)揮作用；Chen等[10]發(fā)現(xiàn)miR-29a通過影響小鼠模型中的血管緊張素原的表達，從而抑制了早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中的RNV。眾多研究指出miR-132對血管形成發(fā)揮重要作用[11-13]，并且缺氧能顯著上調(diào)miR-132的表達水平[14]，但是miR-132參與血管形成的機制，尤其是影響RNV形成的機制尚不完全清楚。

基因芯片檢測主要是指用來檢測基因組DNA和mRNA差異的一種生物技術(shù)裝置，特點是可以快速同時檢測大量的目標(biāo)基因，檢測通量遠遠大于傳統(tǒng)Southern印跡、Northern印跡和定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)等檢測手段[15]。

基于mRNA基因芯片檢測快速和超高通量的優(yōu)勢，本實驗采用基因芯片技術(shù)研究缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)條件下抑制miR-132表達對HRMEC中基因表達水平的影響。研究結(jié)果將有助于進一步了解miR-132調(diào)節(jié)RNV的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞的培養(yǎng) HRMEC購于Cell Systems公司(Kirkland, WA, 美國)。HRMEC培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清(Life TechnoLogies, Carlsbad, CA, 美國)和內(nèi)皮細胞生長添加劑(EGM SingleQuots; Lonza, Basel, 瑞士)的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)液-2(EBM-2; Lonza, Walkersville, MD, 美國)中。細胞的培養(yǎng)環(huán)境為加濕的含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)液每3 d更換1次。對HRMEC做任何干預(yù)前的24 h把培養(yǎng)液換成不添加胎牛血清和生長添加劑的培養(yǎng)液。

1.2 細胞的處理 將HRMEC分成3個組，分別進行以下干預(yù)。①HRMEC細胞對照組：正常培養(yǎng)狀態(tài)下的細胞；②HRMEC細胞+H/R處理組：將HRMEC暴露于一個產(chǎn)生缺氧的密封腔中(0.5% O2)，時長為6 h，然后將細胞培養(yǎng)在常氧條件下(復(fù)氧)，時長為6 h；③HRMEC細胞+H/R處理+miR-132抑制劑組：先使用miR-132抑制劑(終濃度為100 nmol/L)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen Life TechnoLogies，美國)瞬時轉(zhuǎn)染HRMEC，再對上述瞬時轉(zhuǎn)染的HRMEC進行如“②HRMEC+H/R處理組”的干預(yù)。

1.3 RNA提取和質(zhì)檢 使用RNA提取試劑盒Rneasy MiNi Kit(Qiagen, CA, 美國)從HRMEC提取總RNA。RNA質(zhì)控：先使用總RNA質(zhì)檢試劑盒Eukaryote Total RNA Nano(Agilent)處理總RNA，再在生物分析儀2100(Agilent，美國)上進行RNA質(zhì)控檢測。質(zhì)控指數(shù)采用RNA完整性數(shù)值(RIN)。

1.4 基因芯片檢測和分析 基因的差異表達分析使用mRNA微整列(HOA 7.1)實施。該芯片共包含29 204個基因。芯片參考國際公認的RefSeq 及 Ensembl 序列資料庫，設(shè)計長鏈為60個堿基寡核酸的人類表達譜基因探針，內(nèi)容以蛋白質(zhì)編碼基因為主。對RNA樣本標(biāo)記染料分子Cy5，然后將RNA分子雜交到mRNA陣列上。雜交后的陣列使用Agilent 0.1 XDR (Phalanx Biotech, 中國臺灣地區(qū))掃描，接著使用一種專門化的微陣列數(shù)據(jù)儲存和分析的軟件包Rosetta Resolver 7.2 (Merck & Co., Inc, NJ, 美國)進行功能富集分析(gene ontology,GO)。表達譜的聚類分析和可視化使用無監(jiān)督的層次聚類分析法進行(Ernest Orlando Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, 美國)。

1.5 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測 使用RNA提取試劑盒Rneasy MiNi Kit從HRMEC提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen，CA，美國)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用PCR熒光定量試劑盒(Qiagen，CA，美國)檢測cDNA中特定基因的表達水平。引物信息見表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用軟件GraphPad Prism 5(Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA, 美國)進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用附帶Bonferronit檢驗的單因素方差分析來分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對于GO分析的結(jié)果，僅列舉BvsA的前10位集群數(shù)據(jù)，然后對GO分析中排行第1位集群數(shù)據(jù)中基因表達差異>64倍的基因進行局部深度數(shù)據(jù)挖掘分析。

2 結(jié)果

2.1 對基因探針在各分組中信號差異分布的檢測結(jié)果

2.1.1 柱狀圖分析 圖1顯示所有檢出的基因探針(不含控制探針及 flagged 探針)于分組比對中信號差異的分布。由圖1可見：各組間比較的信號差異成正態(tài)分布，屬于正常。

2.1.2 火山圖分析 圖2顯示分組比對中差異基因探針的分布。由圖2可見，分組比對中差異基因探針的分布正常。

2.1.3 差異表達基因的數(shù)量統(tǒng)計 對每組對比的差異基因數(shù)目進行了統(tǒng)計，每一項的變化基因數(shù)目都在2 000左右，提示需要在下一步分析中進行富集處理。

2.1.4 主成分分析 主成分分析用于評估生物重復(fù)及處理條件間的整體差異。圖3表明：第1主成分是H/R處理，第2主成分是加入miR-132抑制劑，變量百分值分別為 53.11%和46.89%。

圖1. 基因探針在各分組中信號差異分布，差異倍數(shù)柱狀圖

圖2. 分組比對中差異基因探針的分布，差異表達基因的篩選閾值為差異倍數(shù)≥1且P<0.05，差異探針標(biāo)示為藍色點

圖3. 主成分分析圖

2.2 對基因探針在各分組中信號的聚類分析結(jié)果 本分析采用無監(jiān)督層次聚類分析(unsupervised hierarchical clustering analysis)來分析實驗樣本間整體基因表達的相似性。由圖4可見，B組和C組的相似性大于B組和A組的相似性以及C組和A組的相似性，符合預(yù)期。

2.3 對基因探針在各分組中信號的GO分析結(jié)果 BvsA的分子功能(MF)的總體分析結(jié)果顯示，排行前3位的集群依次是：GO:0046983～protein dimerization activity、GO:0008092～cytoskeletal protein binding和GO:0042802～identical protein binding。表2是BvsA分子功能具體基因的分析結(jié)果，列舉了排行第1的集群中，表達量差異>64倍的基因[Log2 (B/A)>6或者Log2 (B/A)< -6]。

圖4. 聚類分析

BvsA生物學(xué)過程(BP)的總體分析結(jié)果顯示，排行前3位的集群依次是：GO:0001944～vasculature development、GO:0001568～blood vessel development和GO:0042127～regulation of cell proliferation。表3是BvsA生物學(xué)過程具體基因的分析結(jié)果，列舉排行第1的集群中，表達量差異>64倍的基因[Log2 (B/A)>6或者Log2 (B/A)<-6]。

表2 B vs A分子功能的具體基因分析結(jié)果

表3 B vs A生物學(xué)過程的具體基因分析結(jié)果

BvsA細胞定位(CC)的總體分析結(jié)果顯示，排行前3位的集群依次是：GO:0031012～extracellular matrix、GO:0005578～proteinaceous extracellular matrix和GO:0005604～basement membrane。表4是BvsA細胞定位具體基因的分析結(jié)果，列舉排行第1的集群中，表達量差異>64倍的基因[Log2 (B/A)>6或者Log2 (B/A)<-6]。

表4 B vs A細胞定位的具體基因分析結(jié)果

2.4 富集GO分析結(jié)果的深度分析 對BvsA的數(shù)據(jù)進行GO-MF、GO-BP、GO-CC分析，從分析結(jié)果中選取表達量差異>64倍的基因[Log2 (C/B)>6或者Log2 (C/B)<-6]；對于選取的基因，考察它們在CvsA和CvsB中表達量的差異狀況。

表5～7展示了上述分析的結(jié)果，分別涉及GO-MF、GO-BP和GO-CC。表5表明：H/R上調(diào)了CDH13的表達，下調(diào)了TFAP2C和HPGD的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中“必需程度”接近100%的中間執(zhí)行者；同時，H/R上調(diào)了TCF4的表達，下調(diào)了CEBPA的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中的中間執(zhí)行者之一，還存在其他中間執(zhí)行者。表6表明：H/R下調(diào)了IL18的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中“必需程度”接近100%的中間執(zhí)行者；同時，H/R上調(diào)了CXCL8、ANGPTL4、PLAT、PLAU和THY1的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中的中間執(zhí)行者之一，還存在其他中間執(zhí)行者。表7表明：H/R上調(diào)了COL17A1、TNC和MMP14的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中“必需程度”接近100%的中間執(zhí)行者；H/R上調(diào)了GPC6、COL5A2和VCAN的表達，下調(diào)了DCN的表達，而miR-132完全不是上述表達調(diào)控中的中間執(zhí)行者；同時，H/R上調(diào)了ANGPTL4的表達，下調(diào)了PI3的表達，而miR-132是上述表達調(diào)控中的中間執(zhí)行者之一，還存在其他中間執(zhí)行者。

表5 對B vs A的GO-MF數(shù)據(jù)局部深度挖掘的分析結(jié)果

注：N/A示無

表6 對B vs A的GO-BP數(shù)據(jù)局部深度挖掘的分析結(jié)果

注：N/A示無

2.5 RT-qPCR對于基因芯片等檢測結(jié)果的驗證 圖5示，H/R顯著上調(diào)了miR-132的轉(zhuǎn)錄表達，而H/R+anti-miR-132逆轉(zhuǎn)了上述作用；圖6示，H/R顯著下調(diào)了IL-18和PI3的轉(zhuǎn)錄表達，而H/R+Anti-miR-132逆轉(zhuǎn)了上述作用；H/R顯著上調(diào)了ANGPTL4、PI3、COL17A1、MMP14、CXCL8、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、VCAN的轉(zhuǎn)錄表達，而H/R+anti-miR-132逆轉(zhuǎn)了上述作用。

表7 對B vs A的GO-CC數(shù)據(jù)局部深度挖掘的分析結(jié)果

注：N/A示無

圖5. H/R和H/R+anti-miR-132對miR-132轉(zhuǎn)錄表達的影響 與對照組比較，**示P<0.01；Con為對照組，H/R為H/R組，H/R+Inh為H/R+anti-miR-132組

圖6. H/R和H/R+anti-miR-132對IL-18、PI3、ANGPTL4、PI3、COL17A1、MMP14、CXCL8、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、VCAN轉(zhuǎn)錄表達的影響 與對照組比較，*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001； 與H/R組比較，#示P<0.05，##示P<0.01，###示P<0.001；Con為對照組，H/R為H/R組，H/R+Inh為H/R+anti-miR-132組

2.6 查找與RNV密切關(guān)聯(lián)的基因 對于“2.4對富集GO分析結(jié)果的局部深度數(shù)據(jù)挖掘分析”圈定的基因，結(jié)合NCBI Pubmed數(shù)據(jù)庫進行了深度挖掘，進一步在其中圈定了3個與RNV密切關(guān)聯(lián)的基因，它們分別是IL18、ANGPTL4和PI3。

根據(jù)2.4和2.5兩步局部深度數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果，推演出了在H/R條件下miR-132調(diào)節(jié)RNV的分子機制圖(圖7)。

圖7. 在H/R條件下miR-132調(diào)控 RNV的分子機制圖

3 討論

基因芯片檢測產(chǎn)生了大量數(shù)據(jù)。在B/A中，上調(diào)基因數(shù)目為2 207，下調(diào)基因數(shù)為2 482。這表明缺氧和后續(xù)的復(fù)氧導(dǎo)致大量基因表達水平的改變。在C/B中，上調(diào)基因數(shù)目為1 989，下調(diào)基因數(shù)為1 894。由此可見在H/R條件下抑制miR-132也可以影響眾多基因的表達。通過對比B/A和C/B中的差異基因，發(fā)現(xiàn)很多相同的基因。這表明miR-132介導(dǎo)了H/R對部分基因的調(diào)節(jié)。我們對B/A的數(shù)據(jù)進行了GO-MF、GO-BP、GO-CC分析，并重點分析了結(jié)果中差異最顯著的基因，即表達量差異>64倍的基因[Log2 (C/B)>6或者Log2 (C/B)<-6]。生物學(xué)過程分析結(jié)果中排行前3位的集群依次是：GO:0001944～vasculature development、GO:0001568～blood vessel development和GO:0042127～regulation of cell proliferation。這些生物學(xué)過程均與RNV有密切聯(lián)系。由此可見，缺氧和后續(xù)的復(fù)氧主要影響了血管的生成。

我們進一步考察了B/A中差異最顯著的基因在C/A和C/B中的變化狀況。H/R上調(diào)了CDH13、COL17A1、TNC、MMP14的表達，下調(diào)了TFAP2C、HPGD、IL18的表達，miR-132是上述表達調(diào)控中“必需程度”接近100%的中間執(zhí)行者。H/R上調(diào)了TCF4、CXCL8、ANGPTL4、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、COL5A2和VCAN的表達，下調(diào)了CEBPA、DCN、PI3的表達，miR-132是上述表達調(diào)控中的中間執(zhí)行者之一，還存在其他中間執(zhí)行者。這些結(jié)果表明miR-132介導(dǎo)了H/R對這些基因的調(diào)節(jié)。

通過在NCBI Pubmed數(shù)據(jù)庫進行查詢，發(fā)現(xiàn)3個與RNV密切關(guān)聯(lián)的基因，它們分別是IL18、ANGPTL4和PI3。對于IL18，Singh等[15]發(fā)現(xiàn)血管增生促進物同型半胱氨酸處理視網(wǎng)膜色素細胞(RPE)后，IL18的表達被下調(diào)，提示IL18可能是RNV的抑制物；Doyle等[16]報道玻璃體內(nèi)注射IL18能治療恒河猴的年齡相關(guān)性黃斑退化，提示IL18可以作為抗VEGF治療的輔助物，在抑制RNV中發(fā)揮作用；Shen等[17]報道IL8具有抗?jié)B透和抗血管生成的作用，與VEGF之間存在相互抑制。在本研究中，發(fā)現(xiàn)H/R能顯著下調(diào)IL18的表達，與上述報道相符，而且我們進一步創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)miR-132是這一過程的“中間執(zhí)行者”，具有100%的“必需程度”。對于ANGPLT4，Jee等[18]報道了在增生性鐮狀視網(wǎng)膜病變(proliferative sickle retinopathy, PSR)中，ANGPTL4顯著上調(diào)，提示其在RNV過程中的促進作用，并且是治療PSR的潛在靶點；Babapoor-Farrokhran等[19]報道在增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)中，ANGPTL4是強烈促進血管生成的促進物；Yokouchi等[20]報道了ANGPTL4能在體外促進視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的血管生成活性。在本研究中，發(fā)現(xiàn)H/R能顯著上調(diào)ANGPTL4的表達，與上述報道相符，而且進一步創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)miR-132是這一過程的“中間執(zhí)行者”，具有<100%的“必需程度”，與“其他中間執(zhí)行者”共同上調(diào)ANGPTL4的表達。對于PI3，Alvarez等[21]報道抑制PI3可以抑制視網(wǎng)膜增生。在本研究中，發(fā)現(xiàn)H/R能顯著下調(diào)PI3的表達，我們進一步創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)miR-132是這一過程的“中間執(zhí)行者”，具有<100%的“必需程度”，與“其他中間執(zhí)行者”共同下調(diào)PI3的表達。

COL17A1、MMP14、CXCL8、PLAT、PLAU、THY1、GPC6、VCAN通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的活力、黏附能力和細胞外基質(zhì)的重構(gòu)對血管形成發(fā)揮了重要作用。miR-132通過調(diào)節(jié)這些基因有可能影響RNV。

綜上所述，通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-132介導(dǎo)了H/R對部分基因的調(diào)節(jié)，其中部分基因有可能參與RNV的發(fā)生、發(fā)展，為進一步闡明miR-132調(diào)節(jié)RNV的機制提供了研究基礎(chǔ)。