韓 英，趙恒山，田宇敏，3，王曉勇，劉 帥，蔚慧欣，賈麗艷，，3

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西汾陽(yáng) 032205；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801；3.山西白酒生物工程研究生創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

霉菌是白酒發(fā)酵過(guò)程中重要的一類(lèi)微生物[1]。霉菌產(chǎn)生的糖化酶、液化酶、酯化酶，可以使淀粉分解，促進(jìn)酯類(lèi)物質(zhì)形成[2-3]；霉菌在代謝過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，賦予白酒一定的風(fēng)味[4-5]。目前，關(guān)于霉菌在白酒發(fā)酵中的應(yīng)用主要集中于霉菌的產(chǎn)酶能力和霉菌對(duì)大曲及大曲風(fēng)味物質(zhì)形成的影響方面的研究和應(yīng)用[6-7]，關(guān)于霉菌對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)形成及風(fēng)格影響的研究及應(yīng)用較少。筆者認(rèn)為，白酒發(fā)酵過(guò)程中，霉菌產(chǎn)生酶類(lèi)物質(zhì)的性能不容忽視，霉菌對(duì)白酒風(fēng)格的影響也同樣重要。為此，課題組以風(fēng)味和產(chǎn)酶性能，從傳統(tǒng)清香型白酒的酒醅中分離霉菌，研究不同霉菌對(duì)清香型白酒的發(fā)酵和風(fēng)格的影響并研究霉菌的制曲工藝，以期為清香型及其他白酒的可調(diào)控、機(jī)械化、智能化的發(fā)展提供菌種資源及理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌株：M0為黑曲霉AS3.4309，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

樣品：某清香型白酒廠的新鮮酒醅。

原料：新鮮、干燥、無(wú)蟲(chóng)、無(wú)污染、無(wú)霉變或潮濕酸敗的麩皮。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）[8]：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH 值為自然，121 ℃下滅菌20 min后使用。

產(chǎn)孢子培養(yǎng)基[8]：麩皮∶水=1∶1，121 ℃下滅菌20 min。

儀器設(shè)備：FA1004B 型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；雙列六孔型儀表恒溫水浴鍋，上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；DH-600 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；DL-1 型電子萬(wàn)用爐，天津市大港區(qū)紅杉試驗(yàn)設(shè)備廠；SGD-Ⅳ 型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀；YXQ-50S11 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PB-10 型pH 儀；HZ85-Z 型磁力攪拌機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌的分離、培養(yǎng)

采用孟加拉紅選擇培養(yǎng)基分離菌株。對(duì)分離菌株進(jìn)行麩皮培養(yǎng)：取麩皮15 g 置于250 mL 的三角瓶中，再加15 mL 水，用棉塞和報(bào)紙包好，以121 ℃滅菌20 min，待高壓蒸汽滅菌鍋壓強(qiáng)降至大氣壓時(shí)，取出三角瓶，趁熱將三角瓶中的麩皮打散，再將三角瓶放置于無(wú)菌室，待溫度冷卻至室溫時(shí)分別接種霉菌3 mL 菌液，在無(wú)菌條件下攪拌均勻置于不同溫度下培養(yǎng)84 h，并且每隔24 h 進(jìn)行無(wú)菌攪拌1次。

1.2.2 霉菌的復(fù)篩

通過(guò)菌株強(qiáng)化發(fā)酵生產(chǎn)清香型白酒。經(jīng)品評(píng)和氣相色譜技術(shù)篩選獲取對(duì)清香型白酒品質(zhì)具有影響的功能性霉菌。具體方法如下：將初篩獲得的霉菌制備成麩曲，測(cè)定其糖化力和液化力，通過(guò)強(qiáng)化發(fā)酵的方式，加入酒醅中，添加比例為5%麩曲和5%的大曲，采用“清蒸二次清，固態(tài)地缸發(fā)酵，甑桶蒸餾”的工藝獲取白酒。以傳統(tǒng)大曲清香型白酒生產(chǎn)工藝做對(duì)照。對(duì)蒸餾獲得的白酒進(jìn)行品評(píng)，測(cè)定其理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)。由國(guó)家級(jí)品評(píng)酒師10名對(duì)蒸餾白酒進(jìn)行感官品評(píng)。

采用氣相色譜技術(shù)測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)，具體參考GB/T 10345—2007。

1.2.3 霉菌的鑒定

通過(guò)菌落、菌體形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)手段，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.4 制曲工藝的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

（1）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數(shù)為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無(wú)菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h和120 h，制備成麩曲，測(cè)定麩曲糖化酶活力，每組做3個(gè)平行。

（2）培養(yǎng)溫度對(duì)麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數(shù)為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無(wú)菌麩皮中，混勻，25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測(cè)定麩曲糖化酶活力，每組做3個(gè)平行。

（3）水分含量對(duì)麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將3 mL 孢子數(shù)為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量分別為41%、44%、47%、50%、53%、55%的15 g 無(wú)菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測(cè)定麩曲糖化酶活力，每組做3個(gè)平行。

（4）孢子接種量對(duì)麩曲糖化酶活力及液化酶活力的影響。將1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 孢子數(shù)為107～108cfu/mL 的霉菌孢子菌懸液接種于水分含量為50%的15 g 無(wú)菌麩皮中，混勻，35 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測(cè)定麩曲糖化酶活力，每組做3 個(gè)平行。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以制曲溫度、孢子接種量、培養(yǎng)時(shí)間和水分含量為響應(yīng)變量，糖化酶活力為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)霉菌所制麩曲進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，確定麩曲的最佳制作工藝條件。

1.2.5 麩曲理化指標(biāo)的測(cè)定

（1）糖化酶活力的測(cè)定

糖化酶活力測(cè)定參照《釀酒分析與檢測(cè)》斐林試劑法[9]。

（2）液化酶活力的測(cè)定

液化酶活力測(cè)定參照《釀酒分析與檢測(cè)》碘化滴定法[9]。

（3）水分的測(cè)定

水分測(cè)定按照GB 5009.3—2010 執(zhí)行直接干燥法[10]。

（4）酸度的測(cè)定

酸度的測(cè)定參照GB/T 13662—2008 中和法，以乳酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)[11]。

（5）孢子數(shù)的測(cè)定

孢子數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.15—2010 霉菌和酵母計(jì)數(shù)法測(cè)定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的分離和初篩（圖1）

從酒醅中分離到5 株霉菌，分別為M1、M2、M3、M4和M5，并對(duì)這些菌株的產(chǎn)糖化酶活力進(jìn)行了測(cè)定。由圖1 可知，M1、M2相比M3、M4和M5的糖化酶活力高，但相比對(duì)照菌株M0，M1、M2的糖化酶活力較低，糖化力在200～700 U/g；M3、M4均沒(méi)有明顯的糖化酶活力，M5糖化酶活力也較低。為此，后期以M1、M2為研究對(duì)象，進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 霉菌的復(fù)篩

將初篩獲得的霉菌M1、M2麩曲強(qiáng)化發(fā)酵酒醅，生產(chǎn)清香型白酒。由國(guó)家級(jí)品酒師對(duì)菌種強(qiáng)化發(fā)酵蒸餾白酒進(jìn)行品評(píng)。由表1 可知，M1強(qiáng)化發(fā)酵組的白酒為清香型風(fēng)格，但香氣較淡，帶腥膩，略有異味，酒體較綿柔，醇甜，尾子略苦澀，風(fēng)味較差；M2強(qiáng)化發(fā)酵組的白酒屬清香型風(fēng)格，香帶糧腥味，較醇厚，略雜，略顯醬味，酒體較綿柔，風(fēng)味較好。由表2 可知，霉菌M1、M2強(qiáng)化發(fā)酵生產(chǎn)清香型白酒屬于清香型風(fēng)格，但強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)白酒的理化指標(biāo)和主體骨架成分產(chǎn)生及含量和比例具有一定的影響。由于M2強(qiáng)化發(fā)酵白酒的品評(píng)結(jié)果優(yōu)于M1，為此，后期主要以菌株M2為對(duì)象開(kāi)展研究。

圖1 不同菌株的糖化酶活力

表1 不同菌株強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)白酒的感官影響

2.3 霉菌M2的鑒定

霉菌M2在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落圓形，邊緣整齊，致密絨毛狀；菌絲發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)快，生長(zhǎng)初期呈疏松、白色，匍匐菌絲透明發(fā)達(dá)，后稠密，顏色變?yōu)榛疑▓D2）；菌絲無(wú)隔，菌體產(chǎn)黑色孢子囊，孢子較小，呈橢圓形或圓形。孢囊梗由生假根處的匍匐菌絲長(zhǎng)出，多數(shù)成叢生、少數(shù)單生，囊軸呈圓形，無(wú)囊基、囊領(lǐng)，菌絲體無(wú)橫隔（圖3），M2的孢子色澤為黑色、橢圓形（圖4）。初步鑒定為根霉（Rhizopus）。

通過(guò)對(duì)菌株M2的ITS1-5.8SrDNA-ITS2 區(qū)域序列進(jìn)行測(cè)序，與Genbank DNA 序列庫(kù)同源性序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株M2與米根霉（R.oryzae）序列相似性為100%（表3）。

表2 菌株強(qiáng)化發(fā)酵酒醅對(duì)白酒理化指標(biāo)及骨架風(fēng)味物質(zhì)的影響

綜合菌落、菌體特征和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株M2為米根霉，將其命名為米根霉（Rhizopus oryzae）M2。見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

2.4 霉菌M2麩曲工藝的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)糖化酶活力的影響。由圖5 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株M2糖化酶活力呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。菌株M2在培養(yǎng)時(shí)間24～72 h，糖化酶活力有所增加但變化幅度不大，；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到84 h 時(shí)，糖化酶活力顯著增大，最大值為728 U/g；在培養(yǎng)時(shí)間84 h 之后，菌株M2的糖化酶活力又逐漸降低，但變化幅度不大。

圖2 菌株M2培養(yǎng)2d的菌落特征圖和培養(yǎng)4 d的菌落特征圖

圖3 M2菌體特征圖（10×40）

（2）培養(yǎng)溫度對(duì)糖化酶活力的影響。由圖6 可知，培養(yǎng)溫度在25～40 ℃之間時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，M2糖化酶活力逐漸升高；當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，M2的糖化酶活力達(dá)到最高值，為813 U/g；培養(yǎng)溫度為35～45 ℃時(shí)，菌株M2的糖化酶活力逐漸下降。

（3）水分含量對(duì)糖化酶活力的影響。由圖7 可知，隨著水分含量的增加，菌株M2的糖化酶活力在水分含量為50%～60%時(shí)，呈急速上升趨勢(shì)，當(dāng)水分含量為60%時(shí)，M2的糖化酶活力達(dá)到最高值，為915 U/g；水分含量達(dá)到60%～70%時(shí)，菌株M2的糖化酶活力緩慢下降。

表3 霉菌M2ITS1-5.8Sr DNA-ITS2同源性序列比對(duì)結(jié)果

圖4 菌株M2的孢子（10×40）

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株M2糖化酶活力的影響

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)M2糖化酶活力的影響

（4）孢子接種量對(duì)糖化酶活力的影響。由圖8可知，隨著孢子接種量的增加，菌株M2的糖化酶活力呈先上升后下降趨勢(shì)，接種的菌液為1～3 mL時(shí)，糖化酶活力急劇上升；當(dāng)孢子接種量為3 mL時(shí)，糖化酶活力達(dá)到最高值，為815 U/g；當(dāng)接種量增加為3～5 mL時(shí)，糖化酶活力呈下降趨勢(shì)。

圖7 水分含量對(duì)菌株M2糖化酶活力的影響

圖8 孢子接種量對(duì)菌株M2糖化酶活力的影響

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在上述4 組單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、水分含量和孢子接種量作為響應(yīng)面優(yōu)化考察因素，以糖化酶活力為響應(yīng)面Y 值，設(shè)計(jì)4 因素3水平試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5，各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)及系數(shù)估計(jì)見(jiàn)表6。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可以看出D作用顯著，AC、BC、A2、B2、C2、D2作用極顯著。

由表7 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析可知，P 值＜0.01，表明該模型極顯著，且失擬項(xiàng)P=0.18＞0.05，表明不顯著，該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合性較好；R-Squared=0.9462，表明該方程相關(guān)性很好；該試驗(yàn)C.V.%=2.23＜10，表明該試驗(yàn)的可信度和精確度高；精確度Adeq Precision=12.516＞4，表明該模型是合理的。因此，該模型可以使用，適應(yīng)性良好。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素表

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表7 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析表

從圖9 等高線可以直觀地看出，A（時(shí)間）與C（水分）交互作用顯著。從圖9 三維立體可以看出，純種M2曲的糖化酶活力在合適的反應(yīng)A（時(shí)間）和C（水分）下，具有最大值，該最大值出現(xiàn)在反應(yīng)A（時(shí)間）值（84～90 h），C（水分）值（59%～61%）。

圖9 時(shí)間（A）和水分（C）交互作用對(duì)糖化力影響的響應(yīng)面與等高線圖

從圖10 等高線可以直觀地看出，B（溫度）與C（水分）交互作用顯著。從圖10 三維立體中可以看出，菌株M2曲的糖化酶活力在合適的反應(yīng)B（溫度）和C（水分）下，具有最大值，該最大值出現(xiàn)在反應(yīng)B（溫度）值（40～41 ℃），C（水分）值（59%～61%）。

圖10 水分（C）和溫度（B）交互作用對(duì)糖化力影響的響應(yīng)面與等高線圖

綜上所述，確定最佳試驗(yàn)條件：培養(yǎng)時(shí)間為84.35 h，培養(yǎng)溫度為40.12 ℃，水分含量為59.86%，孢子接種量為2.78 mL，此時(shí)的預(yù)測(cè)糖化力為938.058 U/g。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

考慮到實(shí)際操作的可行性，將制曲條件修正為：培養(yǎng)時(shí)間為84 h，培養(yǎng)溫度為40 ℃，水分含量為60%，孢子接種量為3×107～108cfu/mL。該條件下實(shí)際生產(chǎn)的麩曲糖化力為917 U/g，符合預(yù)測(cè)值誤差范圍。

2.6 菌株M2麩曲的感官及理化指標(biāo)分析

由圖11 可以看出，M2麩曲呈棕色，有光澤，疏松不易結(jié)塊。此時(shí)，麩曲的理化指標(biāo)為：糖化力917 U/g，液化力0.72 U/g，水分含量8.34%，酸度0.84 g/L。

3 結(jié)論

圖11 菌株M2麩曲

本研究從傳統(tǒng)清香型白酒酒醅中分離篩選獲得1 株能賦予清香型白酒具有醬感的菌株M2；經(jīng)過(guò)菌落、菌體特征和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為米根霉（R.oryzae），該菌株具有產(chǎn)糖化酶和液化酶的能力。

以糖化酶活力為測(cè)定指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化菌株M2制曲工藝，獲得最佳制曲工藝條件為：培養(yǎng)時(shí)間84 h，培養(yǎng)溫度40 ℃，水分含量60%，孢子接種數(shù)3×107～108cfu/mL，此時(shí)，菌株M2麩曲糖化力達(dá)到最大值，為917 U/g。

利用菌株M2所制備麩曲的理化指標(biāo)為：糖化力917 U/g，液化力0.72 U/g，水分含量8.34%，酸度0.84 g/L。

以上研究為該菌株強(qiáng)化發(fā)酵應(yīng)用于清香型白酒生產(chǎn)中，奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)，也為白酒的可調(diào)控化、機(jī)械化和智能化的發(fā)展提供了菌種資源。后期應(yīng)繼續(xù)基于風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)，研究該菌株賦予白酒的特征物質(zhì)，并對(duì)其形成機(jī)制作進(jìn)一步研究。