余正軍 范曉培

摘 要：為了獲得蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性突變體，在室內(nèi)通過對親本敏感菌株進(jìn)行藥劑馴化和紫外線的聯(lián)合誘導(dǎo)，獲得了抗嘧霉胺突變體。結(jié)果表明：在自然條件下很可能產(chǎn)生高抗性的抗嘧霉胺突變體。

關(guān)鍵詞：灰霉病菌;嘧霉胺;藥劑馴化;紫外線誘導(dǎo);抗性突變體

近年來，由于長期單一使用同一種農(nóng)藥，病蟲害的抗藥性也隨之增強(qiáng);因此我國的科技工作者對農(nóng)作物的病害防治方面做了大量的研究。在我國引進(jìn)嘧霉胺防治灰霉病害后，在一段時間內(nèi)極大地提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量，病蟲害也降低到了一個較低的水平。但過了3-4年后，在浙江、江蘇和湖南等地就出現(xiàn)了關(guān)于灰霉病菌對嘧霉胺產(chǎn)生了抗藥性的報(bào)道。因此本研究在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)之上，在室內(nèi)對灰霉病菌進(jìn)行了抗性誘導(dǎo)，了解蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性水平，以便采取相應(yīng)的治理對策，延緩嘧霉胺的施用年限。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

（1）材料。供試菌株TG30和YX45由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)研究人員從蔬菜保護(hù)地上分離得到。

供試殺菌劑：96.1%嘧霉胺原藥，由山東雙星農(nóng)藥廠提供。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL

含藥培養(yǎng)基：96.1%嘧霉胺原藥用丙酮配成10?g/mL的母液，然后把母液放在4℃的冰箱中貯藏。使用時以無菌水進(jìn)行稀釋，以10%藥液量加入融化的PDA培養(yǎng)基中（冷卻至45℃～50℃）充分搖勻，制成含最終所需藥量的PDA平板，

（2）儀器。主要儀器：HD-29型凈化操作臺（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），SPX型智能生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），DHG-9140型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海審安醫(yī)療器械廠），A205型萬分之一電子天平（德國），微波爐（青島海爾集團(tuán)）。

2.試驗(yàn)方法

（1）紫外線誘導(dǎo)。將與相對敏感基線相接近的TG30和YX45作為供試菌株，將其在PDA平板上培養(yǎng)4d后，加入8-10mL無菌水，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，制成懸浮液于到入三角瓶中，用無菌水稀釋，在10×10倍顯微鏡下檢查孢子濃度，以每視野50-60個孢子為宜。用移液槍吸取孢子懸浮液200?L注入PDA平板中，用涂布器均勻涂抹，使孢子分散開，打開蓋放在超凈工作臺內(nèi)，紫外燈下20cm處進(jìn)行照射，每照射20min后就從菌落邊緣取3塊菌塊，將菌塊轉(zhuǎn)接到新的含藥培養(yǎng)基上，用牛皮紙包好迅速放于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，直至能再含藥平板上生長、形成扇形的突變體。

（2） 藥劑馴化。將供試菌株TG30和YX45在PDA平板上培養(yǎng)3d后，取生長邊緣菌塊移入含嘧霉胺1μg/mL的PDA平板上，25℃下連續(xù)繼代培養(yǎng)進(jìn)行藥劑馴化，10d作為1代。自每代的菌落邊緣取菌絲塊接入含藥平板上培養(yǎng)，采取相同方法逐步提高藥劑濃度直至獲得能在含500μg/mL嘧霉胺平板上生長的抗性抗性突變菌株，則表明菌株這一繼代培養(yǎng)物已對嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性，即得到了抗藥性菌株。

（3）紫外線誘導(dǎo)和藥劑馴化。紫外線誘變參照Bruin等介紹的方法：將嘧霉胺親本敏感菌株TG30和YX45接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)4d后，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為4mm的菌塊，洗下孢子制成孢子懸浮液（濃度為8×105個/mL），然后涂在含嘧霉胺亞致死劑量1?g/mL PDA平板上，每平板0.1mL，培養(yǎng)24h后，置于紫外燈（15w，254nm）下照射20min，照射距離為20cm。然后在25℃下黑暗培養(yǎng)10d將幸存菌落轉(zhuǎn)接到含最低抑制劑量嘧霉胺的培養(yǎng)基上，用相同的方法逐步提高藥劑濃度培養(yǎng)，直到獲得抗性突變菌株。半個月后得到在500μg/mL藥劑濃度的培養(yǎng)基上紫外照射20min仍可生長菌株TG30-1、TG30-2、TG30-3、TG30-4、TG30-5、TG30-6、TG30-7、TG30-8。

二、結(jié)果與分析

1.紫外誘導(dǎo)

選取灰霉菌株TG30和YX45作為供試菌株，在室內(nèi)經(jīng)過紫外線照射后，形成一個扇形的突變區(qū)域。由表1可以看出，隨著紫外誘導(dǎo)的時間的不同，灰霉菌株的突變程度也是不同的;紫外線照射的時間在20-40min之間時，TG30的突變頻率是最高的，而隨著照射時間的延長，其突變頻率呈直線下降的趨勢。而YX45在通過照射紫外線照射后，幾乎沒有產(chǎn)生突變體，所以就選取TG30作為供試菌株，而蔬菜灰霉菌株TG30在室內(nèi)產(chǎn)生抗嘧霉胺的突變體的最適宜的時間為20-40min。

2.藥劑馴化

選取灰霉菌株TG30和YX45作為供試菌株，在含嘧霉胺的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)10代后，灰霉菌株由原來的最低抑制濃度1μg/mL提高到500μg/mL的濃度，則證明對灰霉菌株的藥劑馴化成功。具體過程由圖1：

3.紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化

由圖2可以看出，蔬菜灰霉菌株TG30的孢子在萌發(fā)的時候，經(jīng)過紫外線誘變7次后，由起初的嘧霉胺最低抑制劑量1μg/mL，提高到在含500μg/mL嘧霉胺的平板上可繼續(xù)擴(kuò)展，則說明蔬菜灰霉病菌的敏感菌株在紫外線誘變和藥劑馴化雙重誘導(dǎo)條件下可突變?yōu)閷︵酌拱返目剐跃辍ＷC明抗性誘導(dǎo)成功。

三、小結(jié)與討論

任何一種新農(nóng)藥在被投放到市場之前，都要對其抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，為蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用在室內(nèi)對蔬菜灰霉病菌進(jìn)行藥劑馴化、紫外線誘導(dǎo)或者兩者結(jié)合起來進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)。

為了獲得蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性突變體，本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)通過對親本敏感菌株TG30進(jìn)行藥劑馴化和紫外線的聯(lián)合誘導(dǎo)，獲得了抗嘧霉胺突變體;而藥劑馴化或紫外線對敏感菌株TG30單獨(dú)誘導(dǎo)出的抗嘧霉胺突變體的抗性倍數(shù)并不等于聯(lián)合誘導(dǎo)出的抗嘧霉胺突變體的抗性倍數(shù)，由此可以推斷，藥劑自然條件下能否得到合理使用，這對于蔬菜灰霉病菌抗藥性的產(chǎn)生起著非常重要的作用，如果長時間使用一種藥劑防治灰霉病害，就很容易使灰霉病菌對藥劑產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致灰霉病菌對藥劑的敏感程度降低，最終很可能失去其應(yīng)有的防治效果。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)該合理使用農(nóng)藥，在藥劑對病原菌產(chǎn)生抗藥性后，應(yīng)改變防治方法，制定合理的防治對策，從而延長藥劑的使用年限，避免病害的大面積發(fā)生。

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