林碧霞，蒙佩怡，陳夢玲，吳峻宇，冷江東，黃月梅，楊詩意，俞 英

(華南師范大學(xué) 廣州市生物醫(yī)藥分析化學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510006)

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素，被應(yīng)用于畜牧業(yè)中抗菌殺菌[1]。殘留在農(nóng)畜產(chǎn)品的卡那霉素有可能通過食物鏈進入人體，從而對人體健康造成危害[2]。因此，建立卡那霉素的靈敏檢測方法具有重要意義。目前，卡那霉素的檢測方法包括色譜法[3]、酶聯(lián)免疫分析法[4]、電化學(xué)法[5]、拉曼光譜法[6]等。但上述方法大多存在操作繁瑣、檢測時間長等缺點。熒光分析法因為具有優(yōu)良的選擇性和靈敏度，且操作簡單，被廣泛應(yīng)用于各種目標(biāo)物的分析檢測[7-9]。

圖1 銀納米簇檢測卡那霉素的原理圖Fig.1 Detection principle of kanamycin by silver nanoclusters

銀納米簇(AgNCs)作為一種新型熒光納米材料吸引了廣泛關(guān)注[10-11]，尤其是以DNA為模板合成的銀納米簇，可以同時具備發(fā)光功能和識別功能，避免了以往熒光探針制備中復(fù)雜的熒光分子標(biāo)記過程和識別分子修飾過程[12-13]。目前以DNA為模板合成銀簇主要用于檢測目標(biāo)DNA[14-15]和大分子[16]，較少用于小分子的檢測，如Yang[17]等以miRNA的互補DNA為模板合成銀納米簇，并用于miRNA的檢測；Cao[18]等以銀納米簇為熒光探針，建立了對人類免疫缺陷病毒(HIV)基因、乙型肝炎病毒(HBV)基因和人類T淋巴細胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)基因的檢測。

本文基于DNA模板合成的銀納米簇建立了檢測卡那霉素的熒光方法，檢測原理如圖1所示：以DNA模板合成的銀簇?zé)晒夂苋酰?dāng)加入目標(biāo)物卡那霉素時，由于DNA模板上的適配體序列識別卡那霉素，適配體形成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并使其G、C堿基靠近銀簇序列，同時DNA二級結(jié)構(gòu)的改變使大顆粒的銀納米粒子分散為小顆粒的銀簇，導(dǎo)致銀簇?zé)晒庠鰪?，根?jù)該原理建立了“點亮型”熒光法檢測卡那霉素。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

卡那霉素(純度94%)、鏈霉素(99%)、四環(huán)素(96%)、金霉素(99%)、多西環(huán)素(99%)、土霉素(95%)、環(huán)丙沙星(99%),均購于上海阿拉丁試劑公司；硝酸銀、硼氫化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉(分析純，天津致遠化學(xué)試劑公司)；各種序列的DNA由上海生工合成，并經(jīng)高效液相色譜純化，其具體序列見表1，其中合成銀簇的DNA有5種不同序列(下劃線堿基序列)，分別命名為AgDNA1、AgDNA2、AgDNA3、AgDNA4、AgDNA5，無下劃線堿基序列為卡那霉素的適配體序列，命名為kan1；實驗所用水均為超純水；牛奶和蜂蜜樣品購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

熒光光譜用日本日立F-4600型熒光光譜儀測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，激發(fā)電壓為700 V，掃描速度為300 nm/min。紫外光譜(UV-Vis)用日本島津2700型紫外-可見分光光度計測定。透射電鏡譜圖(TEM)用日本電子JEM-2100HR 透射電子顯微鏡測定。

表1 本實驗使用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in the experiment

1.2 銀納米簇的合成

銀納米簇的合成參考文獻[12]改進：用20 mmol/L檸檬酸緩沖溶液(pH 7.5)配制15 μmol/L的DNA溶液。將DNA溶液在95 ℃水浴中加熱5 min，再迅速放至冰水浴中保持1 h。取新制的90 μmol/L 硝酸銀溶液逐滴滴至上述配制的DNA溶液中，渦旋振蕩2 min后，于冰水浴中保持15 min。隨后，迅速加入90 μmol/L新鮮配制的硼氫化鈉溶液，渦旋振蕩4 min。此時，反應(yīng)體系中DNA、硝酸銀和硼氫化鈉的濃度比為1∶6∶6。將混合溶液放置在4 ℃下避光反應(yīng)12 h，得到5 μmol/L的銀納米簇(以加入DNA的濃度計算)。

1.3 卡那霉素檢測方法的建立

在一系列比色管中依次加入30 μL 5 μmol/L的銀納米簇溶液、40 μL 20 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH 7.5)和30 μL不同濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。渦旋混合均勻后于16 ℃搖床中反應(yīng)80 min。測定各反應(yīng)溶液的熒光強度，并以卡那霉素的濃度為橫坐標(biāo)，熒光增強倍數(shù)(F/F0,F0、F分別為銀簇加入卡那霉素前后的熒光強度)為縱坐標(biāo)，繪制銀簇測定卡那霉素的工作曲線。

1.4 實際樣品的檢測

取1 mL牛奶或蜂蜜，加入4 mL冰浴冷凍后的甲醇溶液，渦旋混合30 s后，置于冰水浴中靜置15 min，然后以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。收集上清液并用0.22 μm 濾膜過濾，蒸干，重溶殘渣并用0.22 μm 濾膜再次過濾，最后稀釋定容至10 mL。

取30 μL上述牛奶或蜂蜜樣品代替卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”實驗方法處理并進行熒光強度測定，根據(jù)建立的工作曲線計算得到待測樣品溶液中卡那霉素的濃度。為了評價方法的準(zhǔn)確度，兩種樣品溶液分別加2.5、5.0、7.5 μmol/L卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定加標(biāo)樣品溶液中卡那霉素的濃度，計算回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA模板的優(yōu)化

DNA模板包括兩部分的堿基序列，一部分用于合成銀納米簇，命名為AgDNA序列，另一部分用于識別目標(biāo)物卡那霉素，命名為kan1序列。對AgDNA序列進行優(yōu)化，并探討其位置變化對熒光的影響。

2.1.1 合成銀簇的優(yōu)化由于AgDNA序列不同時，合成銀簇的熒光性能會不同，造成對目標(biāo)物檢測靈敏度也不同，因此很有必要對合成銀簇序列進行優(yōu)化。目前文獻報道的常用于合成銀簇的序列包括CCC TTT AAC CCC、CCT CCT TCC TCC、CCC TAA CTC CCC、CCC TTA ATC CCC、ACC CAC CCA，分別命名為AgDNA1、AgDNA2、AgDNA3、AgDNA4、AgDNA5序列。保持DNA模板中卡那霉素適配體序列相同，均為kan1序列，且在DNA模板的3′端，改變合成銀簇的序列分別為上述5種序列，得到AgDNA1-kan1，AgDNA2-kan1，AgDNA3-kan1，AgDNA4-kan1，AgDNA5-kan1 5種不同的DNA模板(具體序列見表1)。用該5種模板按相同合成方法分別合成銀簇，然后加入卡那霉素，測定5種DNA模板合成的銀簇加入卡那霉素前后的熒光變化情況。如圖2所示，合成銀簇的激發(fā)峰和發(fā)射峰位置和強度均會隨銀簇序列的改變而改變。此外，5種DNA模板合成的銀簇加入卡那霉素后熒光均能發(fā)生不同程度的增強，熒光增強倍數(shù)從大到小依次是AgDNA4-kan1> AgDNA2-kan1>AgDNA1-kan1 >AgDNA5-kan1 >AgDNA3-kan1。由于用AgDNA4-kan1作為模板合成的銀簇加入卡那霉素時熒光增強最明顯，靈敏度最高，因此實驗選取AgDNA4序列為最佳合成銀簇序列。

圖3 DNA模板中合成銀簇序列位置的優(yōu)化Fig.3 Optimization of sequences position for silver nanoclusters in DNA templates

2.1.2 合成銀簇序列位置的優(yōu)化為了探究DNA模板中合成銀簇序列的位置是否會影響合成銀簇檢測目標(biāo)物的靈敏度，設(shè)計3種銀簇序列位置不同的DNA模板:AgDNA4-kan1，kan1-AgDNA4，AgDNA4-kan1-AgDNA4(具體序列見表1)。該3種DNA模板中，卡那霉素適配體序列部分相同，均為kan1序列，合成銀簇序列均為AgDNA4序列，其分別在DNA模板的5′端、3′端以及同時存在于5′端和3′端。用該3種模板按相同方法分別合成銀簇，然后加入卡那霉素，測定3種DNA模板合成的銀簇加入卡那霉素前后的熒光變化情況。如圖3所示，當(dāng)合成銀簇序列在DNA模板的5′端時，合成銀簇加入卡那霉素后熒光增強最為明顯，因此，選取DNA模板中合成銀簇序列在5′端為最優(yōu)。

2.2 銀簇合成條件的優(yōu)化

對合成銀納米簇時緩沖溶液的pH值、反應(yīng)物濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行考察，以增加加入目標(biāo)物卡那霉素后熒光的增強程度，提高檢測靈敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)pH值在7.5～8.5時，熒光增強程度最大，實驗選取pH 7.5為最佳pH值(圖4A)。當(dāng)DNA、硝酸銀和硼氫化鈉三者的濃度比為1∶6∶6時(圖4B)，合成溫度為4 ℃，合成時間為12 h時，熒光增強程度達到最大。因此實驗選取銀簇合成的最佳條件為pH 7.5，DNA、硝酸銀、硼氫化鈉三者濃度比為1∶6∶6，在4 ℃反應(yīng)12 h。

2.3 銀簇的表征

通過紫外吸收光譜、熒光光譜、透射電鏡等方法，考察了合成銀簇的光學(xué)性能和形貌特征。圖5A紫外吸收光譜圖中，DNA在260 nm處有明顯吸收，合成后的銀簇保持了DNA在260 nm處的吸收，但在420 nm多了銀納米粒子(AgNPs)的表面等離子體共振峰。400～650 nm的放大圖則顯示，在555 nm處增加了銀納米簇的吸收峰。圖5B熒光光譜圖中，合成前的DNA無特征激發(fā)和發(fā)射峰，合成后銀簇在565 nm處有明顯的激發(fā)峰，這與合成銀簇在555 nm有紫外吸收相符。在該波長激發(fā)下，可觀察到624 nm處呈現(xiàn)發(fā)射峰。為了表征合成銀簇的形貌和粒徑情況，對其進行了透射電鏡分析(圖5C)，結(jié)果顯示，合成銀簇的分散性良好、大小均一。用高分辨透射電子顯微鏡對其進行表征，可看到銀簇尺寸約為5 nm，并呈現(xiàn)明顯的晶格條紋。為了探討銀簇的穩(wěn)定性能，對銀簇的抗光漂白性能進行考察，結(jié)果顯示，銀簇在565 nm激發(fā)波長的持續(xù)照射下，1 h后熒光強度仍保持90%以上，表明合成的銀簇穩(wěn)定性較好。

圖5 銀納米簇的表征Fig.5 Characterization of silver nanoclustersA.UV absorption spectra；B.fluorescence spectra；C.TEM image；insert:HRTEM image of silver nanoclusters

2.4 銀簇檢測卡那霉素的機理

對銀簇加入卡那霉素前后的熒光及紫外吸收光譜圖進行掃描(圖6)，以考察銀簇檢測卡那霉素的機理。結(jié)果顯示，銀簇中加入卡那霉素時，銀簇在565 nm的熒光峰位置未改變，但熒光強度明顯增強(圖6A)。在365 nm的紫外燈下觀察加入卡那霉素前后的熒光顏色變化(圖6插圖)，可以清晰看到加入卡那霉素前幾乎無熒光，而加入卡那霉素后溶液呈現(xiàn)明顯的橙色熒光。這與加入卡那霉素前銀簇的熒光很弱，而加入卡那霉素后熒光增強的熒光光譜相符合。同時，由于合成的銀簇?zé)晒夂苋酰欣诮档捅尘案蓴_，提高檢測靈敏度。

圖6B顯示，加入卡那霉素前，銀簇在420 nm和555 nm有吸收峰，分別對應(yīng)銀納米粒子和銀簇的吸收。隨著卡那霉素加入濃度的增加，420 nm處吸收峰的強度逐漸下降并向銀簇的吸收波長移動，同時555 nm處吸收峰的強度逐漸增強，這與加入卡那霉素后熒光增強一致。由于卡那霉素適配體序列的3′端有部分G堿基和C堿基(見表1)，有文獻報道G堿基和C堿基可以增強銀簇的熒光[19-21]，因此可推斷加入卡那霉素后，DNA模板上的適配體序列識別卡那霉素，構(gòu)型由原來的松散狀態(tài)轉(zhuǎn)為發(fā)夾型，使適配體上更多G堿基和C堿基靠近銀簇，從而導(dǎo)致銀簇的熒光增強[12,22]。同時由于卡那霉素引起DNA的二級結(jié)構(gòu)變化可能使銀納米粒子分散，形成小粒徑的銀簇[23]，導(dǎo)致銀納米粒子的數(shù)量減少，其在420 nm處的吸收下降，同時銀簇增多，其紫外吸收和熒光強度均增強。綜上，卡那霉素對銀簇的熒光增強可以歸為兩個原因：一是更多G堿基和C堿基靠近銀簇，提高銀簇?zé)晒?二是銀納米粒子分散成小粒徑的銀簇，導(dǎo)致銀簇數(shù)量增多。

2.5 銀簇檢測卡那霉素的條件優(yōu)化與工作曲線

由于卡那霉素可以增強銀簇的熒光，因此可將銀簇作為熒光探針建立“點亮型”熒光法檢測卡那霉素的含量。首先對檢測過程中銀簇與卡那霉素的反應(yīng)溫度與時間進行優(yōu)化。圖7A和B顯示最佳反應(yīng)溫度和時間分別為16 ℃和80 min。在優(yōu)化最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間下，考察銀簇檢測不同濃度(0、0.075、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、9.0 μmol/L)卡那霉素的響應(yīng)信號。圖7C顯示，隨著卡那霉素加入濃度的增加，銀簇的熒光逐漸增強，且在0.075～8.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)，銀簇?zé)晒庠鰪姳戎?F/F0)與卡那霉素的濃度(C，μmol/L)呈線性關(guān)系，其線性方程為F/F0=0.616 8C+ 0.927 6，相關(guān)系數(shù)為0.995 8，檢出限(LOQ,S/N=3)為36 nmol/L。卡那霉素在一些食品如牛奶、蜂蜜樣品的限量標(biāo)準(zhǔn)為150 μg/L[24]，換算約為258 nmol/L，而本方法的檢出限明顯小于卡那霉素在這些樣品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，說明本方法能滿足限量標(biāo)準(zhǔn)的需求。

圖7 銀簇檢測卡那霉素Fig.7 Detection of kanamycin by silver nanoclustersA.optimization of temperature;B.optimization of time；C.fluorescence spectra of silver nanoclusters with kanamycin at various concentrations

2.6 銀簇檢測卡那霉素的穩(wěn)定性與選擇性

圖8 銀簇檢測卡那霉素方法的選擇性Fig.8 Selectivity of the detection method for kanamycin by silver nanoclusterconcentration of antibiotics：8 μmol/L

為了探究銀簇檢測卡那霉素方法的穩(wěn)定性，選取加入卡那霉素的濃度分別為0.75、5.0、7.0 μmol/L，對日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進行分析。每個濃度測定5 d，每天測定3次，計算得到的日內(nèi)RSD小于6.0%，日間RSD小于6.9%，說明該方法檢測卡那霉素具有較好的穩(wěn)定性。

為了考察銀簇檢測卡那霉素的選擇性，分別選取金霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、土霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素6種常見抗生素，按檢測卡那霉素的方法加入銀簇中，并測定加入前后銀簇?zé)晒鈴姸鹊谋戎担Y(jié)果顯示，當(dāng)加入8 μmol/L各種抗生素時，卡那霉素的加入使熒光明顯增加約6.3倍，鏈霉素增加約2倍，而其他抗生素對銀簇?zé)晒鈴姸鹊挠绊懞苄　ｆ溍顾啬茉黾訜晒鈴姸仁且驗殒溍顾嘏c卡那霉素均為氨基糖苷類抗生素，分子結(jié)構(gòu)非常接近，對卡那霉素適配體的識別會有干擾。但與卡那霉素對銀簇?zé)晒獾脑鰪姵潭认啾?，鏈霉素的熒光增強小很多。該方法對卡那霉素具有很好的選擇性。

2.7 實際樣品的檢測

選取牛奶和蜂蜜作為實際樣品，對實際樣品進行加標(biāo)處理并檢測卡那霉素的含量，以評價該“點亮型”熒光方法在實際樣品測定中的效果。結(jié)果如表2所示，牛奶和蜂蜜樣品均未檢出，分別進行0.2、2.5、5.0、7.5 μmol·L-1濃度水平的加標(biāo)，測得回收率為92.4%～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%～8.0%。結(jié)果表明該方法具有良好的檢測準(zhǔn)確度和精密度，適用于實際樣品中卡那霉素的檢測。

2.8 與其他檢測方法的比較

將本方法與近年報道的卡那霉素?zé)晒鈾z測方法進行比較(見表3)。從表中可看出，有機熒光分子、半導(dǎo)體無機量子點、碳族量子點均可作為發(fā)光元件來建立卡那霉素的熒光分析方法。本方法的靈敏度比用噻唑橙、熒光素二聚體、鉑復(fù)合物、碳點作為發(fā)光元件所建立的熒光方法的靈敏度好。此外，本方法雖比用羅丹明B、熒光素、CdTe作為發(fā)光元件所建立的方法的檢出限高，但本方法的線性范圍更寬，且毒性更低。

表2 實際樣品中卡那霉素的測定(n=3)Table 2 Determination of kanamycin in actual samples (n=3)

*no detected

表3 卡那霉素?zé)晒鈾z測方法的比較Table 3 Comparison of fluorescent methods for kanamycin

圖9 可視化半定量檢測卡那霉素Fig.9 Visual semi-quantitative determination of kanamycinconcentrations of kanamycin( from left to right):0,1.5,3.0,6.0,9.0,12,15,18,21 μmol/L

2.9 可視化半定量檢測卡那霉素

對銀簇中加入卡那霉素后體系的熒光顏色進行探討。從圖9中可看出，在紫外燈下，隨著卡那霉素濃度的增加，檢測體系的顏色由幾乎無熒光逐漸變?yōu)槌壬珶晒?，且顏色不斷加深。因此可以根?jù)檢測體系在紫外燈下的熒光深淺對卡那霉素進行可視化半定量檢測。該方法無需專業(yè)儀器，只需便攜式的紫外燈即可完成，從而為卡那霉素的現(xiàn)場檢測提供了有效方法。

3 結(jié) 論

本文對DNA模板中銀簇序列和位置進行設(shè)計，并優(yōu)化了合成銀簇的pH值、溫度、時間等條件。當(dāng)加入卡那霉素時，DNA模板上的適配體序列識別卡那霉素形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使更多的G、C堿基靠近銀簇序列，同時由于卡那霉素引起DNA二級結(jié)構(gòu)的變化使銀納米粒子粒徑變小，導(dǎo)致銀簇?zé)晒庠鰪?。增強的熒光比值與卡那霉素濃度呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立“點亮型”熒光方法檢測卡那霉素。對牛奶和蜂蜜樣品進行檢測，檢測效果良好。此外，隨著卡那霉素加入濃度的增加，銀簇的橙色熒光不斷加深，據(jù)此可對卡那霉素進行可視化半定量檢測，從而為卡那霉素的現(xiàn)場檢測提供了新方法。