方科益，陳樹(shù)兵，李 雙，徐旭文，周虹玲，李露青，曹國(guó)洲，陳先鋒

(1.寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波 315040；2.寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)公司，浙江 寧波 315040)

海洋生物毒素是海洋生物體內(nèi)存在的一類高活性的特殊代謝成分，通常擁有劇烈毒性，主要由藻類或浮游植物產(chǎn)生，通過(guò)食物鏈傳遞進(jìn)入海洋動(dòng)物體內(nèi)，可在濾食性的軟體貝殼類動(dòng)物、魚類等海產(chǎn)品的組織內(nèi)蓄積。人體一旦過(guò)量食入，將引起中毒反應(yīng)[1-6]。目前，市售海產(chǎn)品中常見(jiàn)的海洋生物毒素種類包括麻痹性貝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)、腹瀉性貝毒(Diarrhetic shellfish poisoning，DSP)、記憶缺失性貝毒(Amnesic shellfish poisoning，ASP)、神經(jīng)性貝毒(Neurotoxic shellfish poisoning，NSP)、河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)、西加毒素(Ciguatoxin，CTX)及其它藻類毒素。根據(jù)其理化性能可以分為親水性和親脂性，其中麻痹性貝毒(PSP)、記憶缺失性貝毒(ASP)、河豚毒素(TTX)及大部分藻類毒素屬于親水性毒素；腹瀉性貝毒(DSP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)及西加毒素(CTX)屬于親脂性毒素[7]。

目前，對(duì)于水產(chǎn)品中海洋生物毒素的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)測(cè)試方法和化學(xué)分析法，早期應(yīng)用廣泛且較為成熟的有小鼠測(cè)試法、免疫分析法等生物學(xué)測(cè)試法。氣相色譜法、薄層色譜法及液相色譜法等化學(xué)分析方法也有一定報(bào)道[8]。近年來(lái)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高靈敏度和高選擇性使其逐漸成為水產(chǎn)品中海洋生物毒素的首選檢測(cè)手段。GB 5009.198-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中失憶性貝類毒素的測(cè)定》等多個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了相應(yīng)海洋生物毒素的定量檢測(cè)方法[9]。在食品殘留及污染物篩查技術(shù)研究中，高分辨質(zhì)譜(HRMS)已得到一定的推廣和應(yīng)用，如靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(Orbitrap MS)及飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(TOF-MS)等可依靠精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性識(shí)別[10-13]。HRMS技術(shù)可通過(guò)全掃描進(jìn)行非定向和未知化合物的篩選，精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性，必要時(shí)還可設(shè)定質(zhì)量數(shù)進(jìn)行二級(jí)掃描，通過(guò)再打碎得到MS/MS譜圖進(jìn)行譜庫(kù)檢索或與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)來(lái)確證待測(cè)物。Monica等[14]采用HRMS實(shí)現(xiàn)了海產(chǎn)品中8種PSP毒素的測(cè)定。

但現(xiàn)有檢測(cè)毒素的方法中，較多僅適用于一類毒素，如于慧娟等[15]采用固相萃取法檢測(cè)10種麻痹性貝類毒素；高通量檢測(cè)方法所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物也均為同一理化性質(zhì)，如Rubies等[16]采用QuEChERS技術(shù)建立對(duì)貝類中脂溶性貝類毒素的高通量檢測(cè)方法。可見(jiàn)研究針對(duì)復(fù)雜的水產(chǎn)品基質(zhì)，建立適用于親水性及親脂性兩類理化性質(zhì)的海洋生物毒素的通用型前處理及檢測(cè)方法具有較大意義。本文選取不同類別和理化性質(zhì)的11種海洋生物毒素作為研究目標(biāo)，建立了基于分散固相萃取技術(shù)(dSPE)和載體輔助液液萃取技術(shù)(SLLE)的前處理及凈化體系，并借助高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀(HPLC-HRMS)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水產(chǎn)品中親水性及親脂性海洋生物毒素的“一站式”提取、凈化及測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，配備ESI源；Hypersile Gold C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm，美國(guó)Thermo Fisher)；電子天平(感量分別為0.1 mg和0.01 g，瑞士Mettler Toledo)；超純水器(美國(guó)Millipore);旋渦混合儀(瑞士Mettler Toledo);超聲波清洗儀(昆山超聲波儀器有限公司)。

乙腈、甲醇(HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia)；氨水、甲酸、甲酸銨、二甲基亞砜、無(wú)水硫酸鎂、中性氧化鋁(AL-N)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；石墨化炭黑(GCB)、C18粉(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。0.1%甲酸：取1 mL甲酸，用水定容至1 000 mL。甲醇-氨水(99∶1)：99 mL甲醇中加入1 mL氨水。流動(dòng)相A為含2 mmol/L 甲酸銨+0.1%甲酸的水溶液：取0.126 g甲酸銨和1 mL甲酸，用超純水定容至1 000 mL；流動(dòng)相B為含 2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸的乙腈水溶液：取0.126 g甲酸銨，1 mL甲酸，用乙腈+水(95+5)定容至1 000 mL。非特別說(shuō)明，所列試劑均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：河豚毒素(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；微囊藻毒素LR、微囊藻毒素RR(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所)；柱孢毒素、軟骨藻酸、脫氨甲?；扛蚨舅亍⑾显宥舅?、新石房蛤毒素、蛤蚌毒素、鰭藻毒素、岡田軟海綿酸(加拿大國(guó)家研究院海洋生物研究所)。11種目標(biāo)物所屬類別及理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

硅藻土柱(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)：處理量3 mL；15 mL具刻度離心管。

1.2 前處理步驟

稱取樣品2.00 g于離心管中，加入2 mL 0.1%甲酸溶液，渦旋振蕩1 min，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液；殘?jiān)尤? mL 0.1%甲酸溶液，渦旋振蕩1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液；取殘?jiān)偌尤? mL乙酸乙酯，渦旋1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液，合并各次離心所得上清液；將合并液加入0.1 g甲酸銨，渦旋振蕩1 min，以9 000 r/min離心5 min，得到上層有機(jī)相和下層水相；將下層水相倒入硅藻土柱中，靜置15 min以上，下接雞心瓶，并向雞心瓶中加入0.5 mL二甲亞砜；在上層有機(jī)相中加入500 mg AL-N、50 mg C18粉和15 mg GCB，渦旋振蕩1 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液，用乙酸乙酯定容至15 mL，混勻后分多次倒至硅藻土柱中，用5 mL甲醇沖洗1次，再用5 mL 甲醇-氨水(99∶1，體積比)溶液沖洗2次，收集洗脫液在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用10 mL甲醇交換1次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇-0.1 %甲酸溶液(1∶1，體積比)定容至2 mL，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，供HPLC-HRMS檢測(cè)。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

高效液相色譜條件：Hypersile Gold C8色譜柱(150 mm × 2.1 mm,3 μm)；流動(dòng)相A：含2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：含2 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸的乙腈水溶液，其中乙腈與水的體積比為95∶5；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；洗脫程序?yàn)椋?～4 min，95%A，4～7 min，95%～5% A，7～13 min,5%A,13～13.1 min，5%～95%A，13.1～18.1 min,95% A。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：HESI-Ⅱ離子源；噴霧電壓：正離子模式3 800 V/負(fù)離子模式2 700 V；氣化溫度：350 ℃；鞘氣壓：N2，35 arb；輔助氣壓：N2，10 arb；離子傳輸管溫度：300 ℃；質(zhì)量范圍：m/z100～2 000。

1.4 定性與定量過(guò)程

根據(jù)精確分子量進(jìn)行定性判斷，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)偏差小于5 ppm。必要時(shí)可通過(guò)觸發(fā)二級(jí)碎片進(jìn)行子離子匹配定性。

分別吸取一定量各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用空白基質(zhì)溶液配制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜方法采用全掃描和正、負(fù)離子切換模式進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)提取一級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量，必要時(shí)可設(shè)置自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)模式進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性，其超高的分辨率有助于解析復(fù)雜的樣品,確保Q-Orbitrap系統(tǒng)能夠在一次色譜運(yùn)行中最大限度地檢測(cè)和鑒定代謝物。

通過(guò)直接進(jìn)樣，對(duì)每種海洋生物毒素的單標(biāo)溶液進(jìn)行全掃描，確定每種物質(zhì)的電離方式和分子離子峰。結(jié)合其結(jié)構(gòu)式及理論質(zhì)量數(shù)，確定各物質(zhì)的最佳電離模式及相應(yīng)母離子的質(zhì)量數(shù)，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞能量，獲得碎裂片段。各物質(zhì)的最優(yōu)參數(shù)如表1所示，其中較為特殊的GTX的最強(qiáng)母離子為[M+H-SO3]+；RR則為雙電荷，母離子為[M+2H]2+。

表1 11種海洋生物毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其方法參數(shù)列表Table 1 List name and method parameters of 11 marine biotoxins standards

(續(xù)表1)

No.AnalyteTypePhysic-chemical character Retention time(min)Exact mass(m/z)Type of parent ion8Dinophysistoxin(鰭藻毒素,DTX)DSPLipophilicity 9.59817.475 1[M-H]-9Okadaic acid(岡田軟海綿酸,OA)DSPLipophilicity 9.29803.459 8[M-H]-10Microcystin LR(微囊藻毒素,LR)CyanotoxinsHydrophilic 8.67995.553 9[M+H]+11Microcystin RR(微囊藻毒素,RR)CyanotoxinsHydrophilic 8.52519.789 9[M+2H]2+

2.2 色譜柱的選擇

由于11種毒素的理化性質(zhì)各異，實(shí)驗(yàn)比較了Hypersile Gold C8色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)、Atlantis T3 色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)及HILIC親水性色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)對(duì)待測(cè)物的分離效果，發(fā)現(xiàn)HILIC親水性色譜柱適合于保留親水性物質(zhì)，但無(wú)法兼顧親脂性物質(zhì)；Hypersile Gold C8色譜柱及Atlantis T3 色譜柱對(duì)極性物質(zhì)的保留均優(yōu)于普通C18色譜柱，但Hypersile Gold C8色譜柱對(duì)親水性物質(zhì)的保留更優(yōu)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Hypersile Gold C8(150 mm×2.1 mm,3 μm)進(jìn)行色譜分離，各物質(zhì)的選擇離子流圖見(jiàn)圖1。

2.3 提取體系的確定

基于分級(jí)提取原理，采用水系(0.1%甲酸溶液)和有機(jī)系(乙酸乙酯)兩類溶劑對(duì)海產(chǎn)品基質(zhì)中理化性質(zhì)各異的目標(biāo)物進(jìn)行提取。其中采用0.1%甲酸可對(duì)堿性親水性目標(biāo)物(如CYN、dc-STX、STX等)進(jìn)行提取，并通過(guò)加入乙腈進(jìn)行蛋白沉淀。采用乙酸乙酯則可實(shí)現(xiàn)對(duì)OA、DTX等親脂性目標(biāo)物的提取。

圖2 不同凈化載體對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Influence of different purification carriers on recoveries of analytes

2.4 dSPE凈化體系的考察

dSPE技術(shù)中常用的凈化載體有C18、PSA、GCB、中性氧化鋁(AL-N)、無(wú)水硫酸鎂等。Rubies等[16]采用QuEChERS法對(duì)水產(chǎn)品中親脂性貝類毒素進(jìn)行凈化，并比較了C18和PSA作為凈化載體的回收率，發(fā)現(xiàn)PSA對(duì)OA、DTX等多種貝類毒素的回收率影響較大。因此，本文僅對(duì)C18、GCB、中性氧化鋁、無(wú)水硫酸鎂4種凈化載體進(jìn)行比較。分別采用500 mg無(wú)水硫酸鎂、500 mg中性氧化鋁粉、15 mg GCB、50 mg C18粉作為凈化載體[16-18]，以DA、STX、OA及LR 4種物質(zhì)為考核對(duì)象，考察了不同凈化載體對(duì)目標(biāo)物回收率的影響(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，無(wú)水硫酸鎂對(duì)STX、LR的回收率影響較大，其回收率分別為32.5%及42.8%；而AL-N對(duì)STX、LR等極性物質(zhì)略有影響，但總體回收率均大于85%；GCB由于其片層結(jié)構(gòu)以及氫鍵作用，對(duì)于含內(nèi)環(huán)、羥基及氨基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均有不同程度的影響，但由于添加量較少，總體回收率大于88%；C18除了對(duì)親脂性的OA略有影響(回收率為87.1%)外，其余3種物質(zhì)的回收率均超過(guò)90%。

進(jìn)一步采用500 mg無(wú)水硫酸鎂、500 mg AL-N、15 mg GCB、50 mg C18粉作為凈化載體對(duì)基質(zhì)液的有機(jī)相進(jìn)行凈化，將凈化前后的基質(zhì)液氮吹至恒重后進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)水硫酸鎂對(duì)油脂等雜質(zhì)雖具有一定的吸附，但效果不突出；AL-N對(duì)油脂的吸附能力最明顯，能有效減少基質(zhì)液中的油脂含量；GCB能將基質(zhì)中的天然色素基本去除；而C18粉對(duì)減少油脂量和吸附色素均有一定效果。結(jié)合回收率和凈化效果，本實(shí)驗(yàn)的dSPE法凈化部分確定采用500 mg AL-N、15 mg GCB和50 mg C18粉3種凈化載體組合。

表2 不同洗脫體系回收率的對(duì)比Table 2 Comparison of recoveries of different elution systems (%)

2.5 SLLE凈化體系的考察

SLLE部分的凈化根據(jù)前處理提取液水相部分的體積，采用處理量3 mL的硅藻土柱。該步凈化的關(guān)鍵在于洗脫體系的優(yōu)化。本文比較了有機(jī)相15 mL乙酸乙酯+乙腈洗脫后，再分別用10 mL乙酸乙酯、5 mL乙酸乙酯+5 mL甲醇、5 mL甲醇+5 mL甲醇(含1%氨水)3種洗脫體系對(duì)待測(cè)物進(jìn)行洗脫，回收率結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，單純使用乙酸乙酯洗脫時(shí)，其對(duì)親脂性物質(zhì)OA具有較好的效果，但其他3種親水性物質(zhì)的回收率欠佳。采用5 mL乙酸乙酯+5 mL甲醇替換后，DA和LR的回收率提升明顯，但STX的回收率提高不明顯。分別用5 mL甲醇和5 mL含氨水的甲醇依次洗脫后，由于在堿性或弱堿性環(huán)境下，堿性化合物以分子態(tài)形式存在，易被甲醇溶劑洗脫，且依次采用乙酸乙酯、甲醇、含氨水甲醇的洗脫順序，減少了水溶性雜質(zhì)，使得4種待測(cè)物均獲得較高的回收率。因此，最終確定采用經(jīng)dSPE凈化的有機(jī)相，以5 mL甲醇、5 mL甲醇(含1%氨水)依次洗脫的程序進(jìn)行。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

將11種待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液用基質(zhì)液稀釋成不同濃度級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并按優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)目標(biāo)物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，11種待測(cè)物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99(見(jiàn)表3)。采用逐級(jí)稀釋的方式，并結(jié)合信噪比S/N>3以及S/N>10的要求，確定方法的檢出限與定量下限。結(jié)果表明，11種毒素的檢出限為1～10 μg/kg，定量下限為2～20 μg/kg，方法具有較高的靈敏度。

表 3 11種海洋生物毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 11 marine biotoxins

2.7 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別選取黃魚、蟶子空白基質(zhì)，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中目標(biāo)物的加標(biāo)濃度分別為定量下限的1、2、5倍，按上述方法處理后，測(cè)定樣品的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見(jiàn)表4)。結(jié)果顯示，上述化合物的回收率為55.6%～122%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.4%～16%，除個(gè)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在偏差，方法的精密度和準(zhǔn)確度基本滿足方法學(xué)的驗(yàn)證要求。

表4 11種海洋生物毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 11 marine biotoxins(n=6)

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)的2個(gè)黃魚樣品、2個(gè)蟶子樣品及2個(gè)梭子蟹樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了在1黃魚及1梭子蟹樣品中分別檢出12.5 μg/kg和19.3 μg/kg河豚毒素，1蟶子樣品檢出21.3 μg/kg鰭藻毒素以外，其余樣品均未檢出毒素。

3 結(jié) 論

本文基于dSPE及SLLE技術(shù)，通過(guò)一次性前處理，完成了對(duì)水產(chǎn)品中親水性及親脂性海洋生物毒素的提取、凈化，并采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS進(jìn)行分析測(cè)定。該方法解決了不同理化性質(zhì)的海洋生物毒素的“一站式”檢測(cè)問(wèn)題，操作簡(jiǎn)便可行，靈敏度及回收率良好，可為水產(chǎn)品中海洋生物毒素的快速篩查提供技術(shù)支撐。