王詩語，王鶴蓉，黃子豪，陳飛，張霞，趙彥斌，朱晨，劉剛，陳惠鵬

1. 安徽大學 物質(zhì)科學與信息技術研究院，安徽 合肥230601；2. 軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院，北京100850；3. 吉林大學 生命科學學院，吉林 長春130012

萜類代謝途徑中，中間產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）是萜類化合物生物合成的必需前體物質(zhì)。1 分子DMAPP與不同分子的IPP 在異戊烯轉(zhuǎn)移酶的作用下生成不同的萜類前體[15]，這些前體在各種萜類合酶（terpenesynthases，TPS）催化下合成不同種類的萜類化合物[16]。自然界中，有機體合成DMAPP 和IPP 有2 種代謝途徑，即1-脫氧木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）途徑和甲羥戊酸（mevalonate，MVA）代謝途徑。DXP 途徑又被稱為甲基赤蘚糖醇磷酸（MEP）途徑，存在于部分古細菌、動物、大多數(shù)藻類及高等植物的葉綠體中，它的前體物質(zhì)與MVA 代謝途徑的前體物質(zhì)有所不同，是丙酮酸和三磷酸甘油醛。MVA 代謝途徑普遍存在于真核細胞中，在部分古細胞和革蘭陽性細菌中也存在[17]。MVA 代謝途徑前體物質(zhì)是乙酰輔酶A，整個過程有6 種蛋白酶參與反應，分別為mvaE表達的蛋白［具有乙酰輔酶A 乙酰 轉(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA acetyltransferase）和3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）2 種活性功能］、mvaS表達的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 合成酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A synthase，HMGS）、ERG12表達的甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）、ERG8表達的磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，MPK）、ERG19表達的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mevalonatepyrophosphate decarboxylase，MPD）、IDI表達的異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）。其中IDI 可催化IPP 和DMAPP 的相互轉(zhuǎn)化，在MVA 代謝途徑中起關鍵作用[18]。

大腸桿菌具有遺傳背景清晰、生長代謝快、易于人工改造等優(yōu)點，一直是生物制造應用領域最為熱門的底盤細胞之一。在利用大腸桿菌合成外源萜類化合物的過程中，大腸桿菌可以通過自身DXP 代謝途徑合成萜類前體物質(zhì)IPP 和DMAPP。但其自身代謝產(chǎn)生的IPP 和DMAPP 并不能滿足萜類化合物的生產(chǎn)需求，有必要對大腸桿菌進行改造，修飾自身的或引入異源的IPP 和DMAPP 合成途徑[19]。Meng 等利用流平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）對微生物通過MVA途徑和DXP 途徑合成IPP 做了相關模擬，結(jié)果表明大腸桿菌中能夠共存這2 種代謝途徑，并且這2 種途徑共存時能提高IPP 的理論最大產(chǎn)值[20]。

隨著單萜化合物蒎烯逐漸獲重視，以大腸桿菌為底盤生物構(gòu)建“微生物工廠”合成蒎烯已被證明是一種可持續(xù)獲取蒎烯的新途徑。

通過調(diào)研，本研究選取了高效GPPS、PS基因以及高產(chǎn)IPP 和DMAPP 的MVA 代謝途徑，對來源于北美巨冷杉的GPPS和PS基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成，分別構(gòu)建共表達載體和融合表達載體，與來自酵母和糞腸球菌異源雜合高效MVA代謝途徑共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后誘導表達，其中MVA 上游途徑為來源于糞腸球菌的mvaE和mvaS基因簇，MVA 下游途徑為來源于釀酒酵母菌的ERG12、ERG8、ERG19和IDI基因，將這4 個基因分別利用傳統(tǒng)的多順子模型和Bio-Brick 方法進行拼接后構(gòu)建2 種不同方案的MVA代謝途徑。將融合表達載體和MVA 代謝途徑共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，高效表達蒎烯，為微生物工業(yè)化生產(chǎn)蒎烯奠定初步基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自康為世紀生物科技有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；pET-24a（+）與pET-30a 為本實驗室保存；pETDuet-1 購自Novagen 公司；pMD18-T 購自寶生物工程有限公司；pACYCDuet-a 購自BioVector 公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、Q5 超保真2×Master Mix、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、清潔回收試劑盒、DNA 快速連接試劑盒、SOC 培養(yǎng)基均購自NEB 公司；酵母基因組DNA 提取試劑盒和溶細胞酶購自天根生化科技（北京）有限公司；α蒎烯和β蒎烯標準品購自Sigma 公司；抗生素購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

高密度培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，酵母提取物11.5 g，胰蛋白胨19.5 g，硫酸銨4 g，三水磷酸氫二鉀18 g，磷酸二氫鉀3 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌20 min；硫酸鎂1.2 g，微量元素母液250 μL 用0.22 μm 膜過濾除菌后加入培養(yǎng)基中。微量元素母液:七水硫酸亞鐵2.8 g，四水氯化錳2 g，七水硫酸鈷2.8 g，二水氯化鈣1.5 g，二水氯化銅0.2 g，七水硫酸鋅0.3 g，溶于250 mL 1 mol/L 鹽酸溶液中，用0.22 μm 膜過濾除菌。

1.2 GPPS-PS表達載體的構(gòu)建

1.2.1 目的基因的獲取 從GenBank 中獲取北美巨冷杉GPPS和PS基因序列，用DNAssist 軟件分析基因序列詳情，根據(jù)密碼子簡并性及大腸桿菌密碼子偏愛性對基因序列進行優(yōu)化，改造稀有密碼子并去掉常用的限制性酶切位點，設計好的核酸序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司人工合成，分別命名為pGPPS-0 和pPS-0。

幼兒美術活動多種多樣，而作為一名幼兒教師，在立足于傳統(tǒng)教學的同時，應該不斷提高自身能力和專業(yè)水平，探索創(chuàng)新，尋求更多更好的方法，為幼兒身心全面發(fā)展提供機會。繪本作為幼兒繪畫活動中一種較好的媒介，以其獨特的表達系統(tǒng)契合幼兒的心理特點，有利于幼兒從中得到積極的情感體驗，從而激發(fā)幼兒將內(nèi)心感受繪于紙上的愿望。

表1 引物序列（1）

1.2.2 構(gòu)建共表達載體 共表達GPPS和PS基因分別由2 個啟動子控制并獨立表達成2 個蛋白，以含目的基因的質(zhì)粒為模板設計引物（表1），擴增目的基因片段，并在GPPS基因兩端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點、PS基因兩端引入NdeⅠ和BglⅡ酶切位點，進行PCR 擴增［98℃ 30 s；98℃20 s，58℃（GPPS）/59℃（PS）20 s，72℃40 s（GPPS）/60 s（PS），30 個循環(huán)；72℃ 2 min］，將擴增的GPPS和PS基因分別酶切連入不同的多克隆位點，構(gòu)建pETDuet1-GPPS-PS，鑒定正確的質(zhì)粒交由華大公司測序。

1.2.3 構(gòu)建融合表達載體 首先將GPPS去掉終止密碼子后利用一個柔性的linker 串聯(lián)PS基因，再以pET-24a（a）為基礎構(gòu)建融合表達載體。根據(jù)融合PCR 的原理設計擴增GPPS和PS的2 對引物（表2），在GPPS的5'端引入BamHⅠ酶切位點，PS的3'端引入XhoⅠ酶切位點，基因間linker 序列為GGTTCTGGT。第1 次PCR 分別擴增GPPS和PS基 因［98℃ 30 s；98℃ 20 s，62℃（GPPS）/63℃（PS）20 s,72℃ 50 s（GPPS）/60 s（PS），30 個 循環(huán)；72℃ 2 min］；第2次擴增以第1次擴增的GPPS和PS的PCR 膠回收產(chǎn)物為模板、GPPS2-F與PS2-R 為引物，擴增GPPS-PS融合片段（98℃30 s；98℃ 20 s，63℃ 20 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃2 min）。對擴增后的膠回收產(chǎn)物和載體pET-24a（+）進行酶切連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子酶切測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET24a-GPPS-PS。

1.2.4 構(gòu)建共表達及融合表達工程菌 分別將共表達載體pETDuet1-GPPS-PS 和融合表達載體pET24a-GPPS-PS 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），工程菌分別命名為E.hzh01 和E.hzh02。將過夜培養(yǎng)的E.hzh.01 和E.hzh.02 按1∶100 的比例分別接種到卡那霉素（Kan）抗性的LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.8～1.0，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，30℃、200 r/min 誘導培養(yǎng)10 h，取全菌進行10% SDS-PAGE，分析基因表達情況。

1.2.5 蒎烯含量檢測 將過夜培養(yǎng)的E.hzh.01 和E.hzh.02 按1∶100 的比例分別接種至含相應抗生素的100 mL 高密度培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.8～1.0，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，在培養(yǎng)基上覆蓋20%的正十二烷溶液，繼續(xù)在30℃、200 r/min 培養(yǎng)72 h，利用GCMS 分別檢測十二烷層和水層蒎烯含量。采用美國安捷倫公司的5975C-7890A 單四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和HP-5MS（60 m×0.32 mm×0.5 μm）色譜柱。質(zhì)譜方法，采用選擇離子掃描模式（SIM），離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃。氣相方法，進樣口溫度200℃，流速2.5 mL/min 恒流模式。分流模式，分流比50∶1；柱溫箱，50℃起始，保持3 min，10℃/min 升至130℃，保持1 min，30℃/min 升至280℃，保持2 min；進樣量1 μL。

表2 引物序列（2）

表3 引物序列（3）

1.3 含MVA途徑產(chǎn)蒎烯工程菌構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建MVA 上游表達載體 設計引物（表3）擴增mvaE和mvaS基因，在其兩端分別加入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點，以軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所方宏清副研究員惠贈的mvaE和mvaS基因為模板進行PCR 擴增（98℃ 30 s；98℃ 20 s，57℃20 s，72℃2 min，30 個循環(huán)；72℃2 min）。

以pACYCDuet-1 為基礎載體，通過對基礎載體和目的基因PCR 產(chǎn)物進行酶切連接構(gòu)建MVA上游途徑表達載體pACYCDuet-mvaE/S。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將酶切鑒定且測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），SDS-PAGE 驗證基因mvaE和mvaS的表達。為了外源雜合MVA 代謝途徑與GPPS-PS融合表達基因更加方便地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用PCR 方法在GPPS-PS融合基因兩端分別引入BglⅡ和PvuⅠ酶切位點進行酶切連接，整合進載體pACYCDuetmvaE/S，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pACYCDuetmvaE/S-GPPS-PS。

1.3.2 多順反子模型原理構(gòu)建MVA 下游表達載體 提取釀酒酵母基因組作為模板，分別PCR 擴增目的基因ERG12、ERG8、ERG19和IDI，選用NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit，根據(jù)多順反子模型原理構(gòu)建基因四串聯(lián)共表達載體。利用NEB 在線工具（NEBuilder Assembly Tool）設計引物（表4）分別擴增目的片段［98℃ 30 s；98℃ 20 s，57℃（ERG12）/57℃（ERG18）/55℃（ERG19）/54.5℃（IDI）/56℃（pET-24a） 20 s，72℃45 s（ERG12、ERG8、ERG19、IDI）/180 s（pET-24a），30 個循環(huán)；72℃2 min］。

利用目的片段之間添加的同源重組片段進行重組連接，將擴增得到的目的片段和pET-24a（+）表達載體與DNA Assembly Master Mix 按照一定比例混合后，50℃溫育60 min，重組反應液直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切測序鑒定，構(gòu)建成功的載體命名為pET24a-ERG12-8-19-IDI。

表4 引物序列（4）

表5 引物序列（5）

1.3.3 BioBrick 原理構(gòu)建MVA 下游表達載體 以酵母基因組為模板，設計引物（表5）分別克隆目的基因ERG12、ERG8、ERG19和IDI，引物設計時分別在基因兩端引入相應的酶切位點（ERG12和IDI酶切位點為NdeⅠ/XhoⅠ，ERG8和ERG19為BamHⅠ/XhoⅠ）。PCR 條件:98℃ 30 s；98℃ 20 s，61℃（ERG12）/59℃（ERG18）/59℃（ERG19）/55℃（IDI）20 s，72℃ 50 s，30 個 循環(huán)；72℃ 2 min。目的產(chǎn)物與pET-30a 載體分別酶切連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，酶切測序鑒定正確的質(zhì)粒分別命名pET30a-ERG12、pET30a-ERG8、pET30a-ERG19、pET30a-IDI。

進一步利用XbaⅠ和SpeⅠ互為同尾酶的原理將4 個BioBrick 單表達載體串聯(lián)一起，構(gòu)建4 個基因共表達載體pET30a-ERG12-8-19-IDI。以pET30a-ERG12、pET30a-ERG8 串聯(lián)為例，對2 個載體分別進行雙酶切，膠回收pET30a-ERG12 大片段及pET30a-ERG8 小片段后進行連接，酶切測序鑒定多基因表達載體，最后鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET30a-ERG12-8-19-IDI。

1.3.4 含MVA 代謝途徑產(chǎn)蒎烯工程菌的構(gòu)建 將pACYCDuet- mvaE/S- GPPS- PS 載體與pET24a-ERG12-8-19-IDI 或pET30a-ERG12-8-19-IDI 載體共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建含MVA 代謝途徑產(chǎn)蒎烯的工程菌E.hzh03 和E.hzh05。將工程菌E.hzh03和E.hzh05 分別接種至含相應抗生素的100 mL 高密度培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.8～1.0，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，在培養(yǎng)基上覆蓋20%的正十二烷溶液，繼續(xù)在30℃、200 r/min 培養(yǎng)72 h，利用GC-MS 檢測蒎烯產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 GPPS-PS表達載體的鑒定

分別克隆GPPS和PS基因序列，在GPPS基因兩端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，PS基因兩端引入NdeⅠ和BglⅡ酶切位點，酶連基因片段到表達載體pETDuet-1 中，酶切并測序顯示成功構(gòu)建共表達載體pETDuet1-GPPS-PS（圖1A）。將共表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞構(gòu)建工程菌株E.hzh.01，誘導表達后SDS-PAGE 分析表明目的條帶與預期大小一致，目的基因在大腸桿菌中成功表達（圖1B）。

利用融合PCR 構(gòu)建GPPS和PS融合表達載體，酶切并測序顯示成功構(gòu)建了融合表達載體pET24a-GPPS-PS（圖1C）。將融合表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞構(gòu)建工程菌株E.hzh.02，誘導表達后SDS-PAGE 分析表明融合蛋白條帶相對分子質(zhì)量約116×103，與預期相符（圖1D），融合基因在大腸桿菌中成功表達。

2.2 蒎烯含量檢測方法的建立

利用GC-MS 方法檢測蒎烯產(chǎn)量，根據(jù)蒎烯標準品的質(zhì)譜分析圖（圖2A）確定α蒎烯及β蒎烯的定性離子和定量離子。根據(jù)蒎烯標準品的氣相色譜圖（圖2B）確定α蒎烯及β蒎烯的保留時間。分別以α蒎烯及β蒎烯的濃度與色譜峰面積制作α蒎烯及β蒎烯的濃度標準曲線（圖2C），結(jié)果顯示α 蒎烯和β 蒎烯的RSD1111 值分別為2.27%和2.12%，證明GC-MS 檢測蒎烯產(chǎn)量的方法重現(xiàn)性良好。

圖1 表達載體酶切鑒定和誘導表達（1）

圖2 GC-MS 檢測蒎烯含量

2.3 目的蛋白融合表達可顯著提高蒎烯產(chǎn)量

將工程菌E.hzh.01 和E.hzh.02 分別接種至含相應抗生素的100 mL 高密度培養(yǎng)基中，待菌液D600nm值為0.8～1.0，加入IPTG 并覆蓋20%的正十二烷溶液，30℃、200 r/min 誘導培養(yǎng)72 h，分別取培養(yǎng)液上層十二烷層和下層菌液（水）層，用GC-MS檢測蒎烯含量，結(jié)果表明十二烷層中蒎烯含量是菌液層的幾十倍，因此后續(xù)研究只取上層十二烷層用于蒎烯含量檢測。進一步檢測得到E.hzh01和E.hzh02 的蒎烯產(chǎn)量分別為0.85 和1.86 mg/L，表明蛋白融合表達可顯著提高蒎烯產(chǎn)量。

2.4 MVA上游表達載體pACYCDuet-mvaE/S的鑒定

設計引物克隆MVA 上游途徑基因mvaE、mvaS，通過酶切連接方式將目的基因連到載體pACYCDuet-a 中，酶切和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了MVA 上游表達載體pACYCDuet-mvaE/S（圖3A）。將表達載體pACYCDuet-mvaE/S 轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21（DE3），誘導培養(yǎng)后SDS-PAGE 驗證MVA 上游基因的表達（圖3B）。mvaE和mvaS表達的蛋白相對分子質(zhì)量分別為86.7×103、42.2×103，與預期相符。進一步設計引物克隆GPPS-PS融合表達基因，將目的基因酶切連接到pACYCDuet-mvaE/S 載體中，酶切鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了表達載體pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS（圖3C），轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后誘導培養(yǎng)，SDSPAGE 驗證載體中目的基因的表達（圖3D），結(jié)果與預期相符。

2.5 MVA下游表達載體pET24a-ERG12-8-19-IDI的鑒定

分別利用多順反子模型原理和BioBrick 方法將ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因連入載體，酶切鑒定并測序顯示成功構(gòu)建了MVA 下游4 基因共表達載體pET24a-ERG12-8-19-IDI（圖4A）和pET30a-ERG12-8-19-IDI（圖4C）。將pET24a-ERG12-8-19-IDI（圖4B）和pET30a-ERG12-8-19-IDI（圖4D）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后誘導培養(yǎng)12 h，取全菌進行SDS-PAGE，結(jié)果表明目的基因蛋白能夠正常表達。

圖3 表達載體酶切鑒定和誘導表達（2）

圖4 表達載體酶切鑒定和誘導表達（3）

2.6 工程菌產(chǎn)蒎烯能力檢測

將pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS 與pET24a-ERG12-8-19-IDI 或pET30a-ERG12-8-19-IDI 載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建得到的工程菌E.hzh03 和E.hzh05 分別接種至含相應抗生素的高密度培養(yǎng)基中，待菌液D600nm值為0.8～1.0，加入IPTG 誘導，再在培養(yǎng)基上覆蓋20%的十二烷溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。取十二烷層并利用GC-MS 方法檢測菌株產(chǎn)蒎烯能力。結(jié)果表明，E.hzh03 和E.hzh05 產(chǎn)蒎烯能力分別為1.86 和19.26 mg/L。

3 討論

蒎烯是重要的天然單帖類平臺化合物，被廣泛用于合成高能燃料、藥品、香料和芳香醇等產(chǎn)品，在軍事、藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領域均有重要的應用價值。目前，在工業(yè)上制造蒎烯的途徑是采用高效精餾塔從脂松節(jié)油或粗硫酸鹽松節(jié)油中分離提取，存在設備及技術要求高、能耗大，分離產(chǎn)物純度不高等缺點。另一方面，工業(yè)上獲取松節(jié)油會消耗大量松屬林木資源，造成了大量不可再生自然資源的浪費。隨著系統(tǒng)生物學與合成生物學技術的快速發(fā)展，以大腸桿菌等底盤生物構(gòu)建“微生物工廠”合成萜類化合物，已經(jīng)被證明是一種可持續(xù)獲取蒎烯的新途徑。本研究以大腸桿菌為底盤細胞，將來源于釀酒酵母和糞腸球菌的外源雜合MVA 代謝途徑基因與來源于北美巨冷杉的GPPS和PS基因共同整合到大腸桿菌中，構(gòu)建了高效合成蒎烯的“微生物工廠”。

IPP 和DMAPP 是代謝合成蒎烯的必需前體物質(zhì)，大腸桿菌可通過其自身的DXP 代謝途徑合成IPP 和DMAPP，再將優(yōu)化的GPPS和PS基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中實現(xiàn)合成蒎烯。本研究分別構(gòu)建了GPPS和PS的共表達和融合表達工程菌株，利用GC-MS 檢測蒎烯產(chǎn)量進行比較，發(fā)現(xiàn)融合表達的GPPS 和PS 蛋白可顯著提高蒎烯在大腸桿菌中的合成效率。利用生物信息學軟件分析融合蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GPPS 和PS 蛋白融合表達時，2 個酶的催化中心相互緊鄰且成面對面的結(jié)構(gòu)。與蛋白共表達比較，顯示蛋白融合表達在降低蛋白毒性的同時提高了蒎烯合成酶的催化速率，降低了底物對酶的反饋抑制作用。

已有研究表明，將外源雜合的MVA 代謝途徑導入大腸桿菌可提高蒎烯前體物質(zhì)IPP 和DMAPP的積累，從而提高大腸桿菌合成蒎烯的效率。本研究選擇的外源雜合MVA 代謝途徑共有6 個酶參與代謝反應，其中上游途徑為來源于糞腸球菌的mvaE和mvaS基因，這2 個基因存在于同一個基因簇上；下游途徑為來源于釀酒酵母菌的ERG12、ERG8、ERG19和IDI基因，這4 個基因分布在酵母基因組不同的位置上。我們運用2 種策略構(gòu)建MVA 下游代謝途徑表達載體，策略一是利用多順反子模型的原理，將基因ERG12、ERG8、ERG19和IDI體外拼接成串聯(lián)序列，再由1 個啟動子控制4 個基因的表達，其中每個基因含有各自的SD 序列和翻譯起始終止信號；策略二是根據(jù)合成生物學中的BioBrick 方法，用同尾酶（SpeⅠ和XbaⅠ）將基因序列快速組裝拼接，其中每個基因都是一個獨立的操縱子模型，其蛋白獨立表達。進一步的實驗結(jié)果表明，將外源MVA 代謝通路和GPPS-PS融合基因共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌能夠顯著提高蒎烯的產(chǎn)量，而多順反子模型原理構(gòu)建的MVA 代謝通路具有更高的蒎烯合成效率。雖然BioBrick 方法更有利于基因組裝，具有一定的優(yōu)勢，但后續(xù)組裝的基因的表達強度隨著體系的增加而減弱，一定程度上不利于含多酶活性系統(tǒng)的組裝，從而限制蒎烯的代謝合成，而利用多順反子模型構(gòu)建的外源雜合MVA 代謝途徑則更有利于大腸桿菌中蒎烯的合成。

本研究比較了GPPS、PS共表達和融合表達條件下蒎烯的合成效率，證明GPPS和PS融合表達更有利于蒎烯合成。進一步比較了不同策略下構(gòu)建的外源雜合MVA 代謝途徑結(jié)合GPPS-PS融合蛋白產(chǎn)蒎烯的能力，構(gòu)建得到了蒎烯產(chǎn)量大幅提高的工程菌株。后續(xù)通過對發(fā)酵培養(yǎng)工藝的進一步優(yōu)化改良，有望為今后蒎烯的大規(guī)模工業(yè)化微生物合成發(fā)展奠定一定的基礎。