郭彤彤，宋 丹，張 鑫

(寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800)

近年來，超重和肥胖逐漸成為人們關注的焦點，并已成為全球經濟和健康的負擔[1]。據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2016年世界上近40%的成年人超重，約有13%的人肥胖，該比例在過去40年中增加了兩倍。肥胖是能量破壞的結果，也是許多慢性疾病的重要危險因素，包括非酒精性脂肪性肝病，II型糖尿病和心血管疾病[2]。因此，肥胖的預防和治療已成為重要的公共衛(wèi)生問題，減肥藥的開發(fā)亦勢在必行。

人體腸道中的微生物多達1014種微生物，比人類細胞總數高10倍，已知的細菌種類至少1000種[3]。這種復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)在人類健康中發(fā)揮著重要作用[4]。研究表明，接受肥胖人類糞便微生物的無菌小鼠比接受正常體重人類糞便微生物的小鼠的體重顯著增加[5]。腸道微生物菌群與肥胖之間的關系引起了學者的廣泛關注。

飲食對腸道微生物的組成，多樣性和豐富度有顯著影響[6]。改變腸道微生物群或補充特定益生元或益生菌可減輕肥胖或糖尿病嚙齒動物模型中的肥胖和代謝功能障礙[7]。茶在世界各地廣泛消費，其推定的活性成分歸因于多酚。烏龍茶多酚(Oolong tea polyphenols, OTP)可以為有益微生物提供有利生長條件，并改變腸道微生物群的結構，發(fā)揮類似的益生元功能[8]。OTP中的主要酚類化合物是兒茶素，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)，表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate, ECG)，表沒食子兒茶素(Epigallocatechin, EGC)和表兒茶素(Epicatechin, EC)，它們是茶中最重要的生物活性物質[9]。作為一種獨特的甲基化形式的EGCG，表沒食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯(Epigallocatechin 3-O-(3-O-methyl)gallate, EGCG3”Me)已顯示出有效的抗肥胖活性[10]。此外，EGCG3”Me有益于腸道菌群系統(tǒng)的穩(wěn)定性，特別是在高脂肪飲食(High fat diet, HFD)誘導的肥胖小鼠模型中引發(fā)的微生物失衡[11]。然而，關于OTP與腸道微生物群之間相互作用的研究鮮見報道。在本研究采用高脂日糧飼養(yǎng)建立高脂肥胖小鼠模型，應用16S rDNA測序技術，探究OTP對HFD小鼠腸道菌群的影響，以期為OTP的深入研究及減肥產品的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑、儀器與動物

1.1.1 試驗試劑

烏龍茶多酚(純度98%)，實驗室自制；TC、TG、HDL-C和LDL-C試劑盒，南京建成生物工程研究所；油紅O染色試劑，美國Sigma公司；氯化鈉、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛購于國藥集團有限公司；DNA提取試劑盒(D4015-02)，美國Omega Bio-tek公司；DL 2000 DNA Maker(3427A)，日本寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖(RA1011-Agarose LE-100G)，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2 試驗儀器

AY-120型電子精密天平(日本Shimadzu公司)；無菌硬質糞便收集袋(上海申安醫(yī)療器械廠)；BioTekSYNERGY H1四光柵全功能酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)；5418R小型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Leica CM1950冷凍切片機(德國Leica公司)；Leica CM2245組織切片機(德國Leica公司)；MX-S/MX-F型旋渦混合器(大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司)；NanoDrop ND-2000型核酸定量儀(美國Thermo公司)。

1.1.3 試驗動物

6周齡、雄性C57BL/6J小鼠(體重為20±2 g)，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于寧波大學試驗動物中心，試驗動物許可證號：SYXK(浙江)2013-0191，溫度控制在22±2℃，濕度控制在55%±5%，自由攝食和飲水，單籠飼養(yǎng)，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組

適應1周后，將小鼠隨機分為3組，低脂飲食組(LFD組)，高脂飲食組(HFD組)，高脂飲食-烏龍茶多酚組(HFD-OTP組，0.1% OTP)，每組8只小鼠。他們的體重，食物和水攝入量每周記錄兩次，并且每周計算他們的平均值。在0周(OTP-0)，2周(OTP-2)，4周(OTP-4)和8周(OTP-8)對HFD-OTP組收集糞便樣品用于16S rDNA測序分析。所有給藥連續(xù)進行8周，然后在戊巴比妥麻醉下進行剖腹手術。分離肝臟和附睪脂肪并立即稱重，并立即將所有樣品快速冷凍并儲存在-80℃直至使用。

1.2.2 血清生化指標檢測

小鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生產的測試盒進行檢測，測定方法嚴格按試劑盒說明進行測定。

1.2.3 肝臟組織病理學檢測

將經過4%多聚甲醛溶液固定24 h后的肝臟組織，進行常規(guī)石蠟包埋，進行油紅O染色，光學顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性程度。

1.2.4 糞便細菌DNA提取與16S rDNA測序分析

參考文獻中報道的方法加以改進用于提取糞便中細菌的總DNA[12]。采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit (D4015-02，Omega，美國)，按照說明書進行。采用NanoDrop system檢測DNA濃度與純度。

參照文獻[13]，取用10 ng的DNA模板，依16S rDNA V3-V4區(qū)序列，用帶Barcode的特異引物(引物序列為314F5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’和805R 5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)進行PCR擴增。根據PCR產物濃度進行等量混樣，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產物。用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，將構建好的文庫經Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，運用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

將各組的樣品數據從下機數據中拆分出來，截去Barcode與引物序列之后，采用FLASH對雙端序列進行拼接，過濾成高質量Tags數據。進行Tags截取與長度過濾，處理去除嵌合體序列，得到最終的有效數據。使用Verseach(Version 2.3.4)軟件過濾嵌合序列，將具有97%一致性序列聚類成為操作單元(OTUs)?；跇悠稯UT結果，使用QIIME軟件(Version 1.8.0)，計算用于分析樣品物種多樣性和豐度的指數包括Chao1，Shannon和Simpson。同時選取OTUs代表性序列，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫對其進行物種注釋且獲得分類學信息，在門(phylum)與屬(genus)分類水平上，統(tǒng)計樣本的群落結構組成并進行分析。

1.2.5 數據處理與分析

數據結果用平均值±標準誤表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料進行Duncan’s多重比較檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 OTP處理可減輕體重，降低脂肪量，減少肝臟脂肪變性

在第8周試驗結束時，比較各組小鼠平均體重，結果如圖1，發(fā)現HFD組和HFD-OTP組小鼠體重與LFD組相比均具有顯著性差異(P<0.05)；HFD-OTP組平均體重顯著小于HFD組(P<0.05)，這表明OTP顯著緩解了肥胖小鼠的體重增加。

鑒于在8周飲食干預期結束時HFD-OTP組的體重增加比HFD組低4.0 g，我們隨后檢查了不同實驗組中脂肪和肝臟組織的變化。在這里，我們發(fā)現經OTP處理后，有效減少了HFD誘導的肥胖小鼠的脂肪量(P<0.01，圖2A)。同時，HFD-OTP組肝臟重量略有下降，與HFD組相比無顯著差異(圖2B)。然而，OTP處理后油紅O染色區(qū)域的百分比顯著下降，表明OTP可以降低HFD誘導的肝臟脂肪積累，降低肝臟病變的風險(圖2C)。

圖1 補充OTP期間各組小鼠體重變化Fig.1 The changes in body weight of mice in each group during OTP supplementation注：LFD組與HFD組比較，#P < 0.05差異顯著，##P<0.01差異極顯著；HFD-OTP組與HFD組比較，*P < 0.05差異顯著，**P < 0.01差異極顯著；圖2同。

2.2 OTP處理對小鼠血清生化指標的影響

研究表明肥胖等疾病有著高水平的總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)[14]。從表1可以看出，與LFD組相比，HFD組小鼠血清TC、TG、LDL-C明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與HFD組相比，HFD-OTP組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低，高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可見，OTP能在一定程度上調節(jié)高脂飲食小鼠體內血脂水平，長期飲用烏龍茶對身體有益。

2.3 OTP處理對飲食誘導肥胖小鼠腸道微生物多樣性的影響

為了構建由HFD誘導的肥胖引起的腸道菌群改變和OTP處理對腸道微生物群的影響，我們通過16S rDNA測序方法，得到了糞便菌群多樣性和菌群豐度。如表2，Chao1指數和Shannon指數隨著OTP處理時間的延長而提高，Simpson指數則隨著OTP處理時間的延長而顯著降低。該結果表明，肥胖小鼠腸道細菌群落的多樣性對著OTP處理時間的延長而增加并且在第8周時達到最大值(P< 0.05)。這說明OTP增加了HFD誘導的肥胖小鼠腸道內微生物菌群的多樣性。

圖2 OTP處理對小鼠脂肪量和肝臟脂肪變性的影響Fig.2 Effect of OTP treatment on fat mass and hepatic steatosis in mice注：A：小鼠脂肪組織重量；B：小鼠肝臟組織重量；C：小鼠肝臟組織油紅O染色圖片(400倍)。

表1 小鼠血清生化指標的變化Table 1 The changes of biochemical parameters of mice.

注：同行中不同字母表示數值間差異性達到顯著水平(P<0.05)；表2同。

表2 OTP對HFD誘導的肥胖小鼠模型的生物多樣性的影響Table 2 The influence of OTP on the biodiversity of the HFD-induced obesity mouse model

為了進一步表明OTP對腸道菌群組成的影響，我們在門(phylum)和屬(genus)水平上比較了不同時間處理下小鼠糞便腸道菌群的結構組成(圖3)。研究表明，在門分類水平上，HFD誘導的小鼠中優(yōu)勢菌群包括擬桿菌門(Bacteroidetes)，厚壁菌門(Firmicutes)，放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)。在4個實驗組中，Actinobacteria和Proteobacteria的相對豐度變化不大，而OTP處理中Bacteroidetes的相對豐度隨著處理時間的增加而顯著增加(P< 0.05)，與此同時，Firmicutes的相對豐度降低(P< 0.05)。這表明菌群Bacteroidetes及Firmicutes對OTP的攝入敏感。此外，F/B從0.80±0.02(OTP-0)降至0.41±0.01(OTP-8)。

熱圖( heatmap) 是以顏色的變化反映各種細菌在樣本中的相對豐度變化。本實驗中，我們利用熱圖對相對豐度較大的前20個細菌OTU在屬的水平進行比較(圖4)，結果表明，在屬的分類水平上，擬桿菌屬(Bacteroides)，另枝菌屬(Alistipes)，雙歧桿菌屬(Bifidbacterium)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，勞特氏菌屬(Blautia)，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，Barnesiella和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等菌群的相對豐度在OTP喂養(yǎng)8周后顯著增加(P< 0.05)。其中，菌群Bacteroides和普雷沃氏菌屬(Prevotella)在每個采樣時間點上均為菌群。同時，菌群Prevotella，Odoribacter，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和梭菌屬XlVa (ClostridiumXlVa)的相對豐度隨著OTP處理時間的延長顯著降低(P<0.05)。

圖3 HFD-OTP組小鼠腸道菌群在門水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of phylum

圖4 HFD-OTP組小鼠腸道菌群在屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of genus

3 結論與討論

肥胖是一種常見的代謝疾病，伴隨著許多健康問題，并可以增加II型糖尿病和相關代謝紊亂的風險[15]。近年來，越來越多的研究表明腸道微生物菌群多樣性和組成變化與肥胖及其并發(fā)癥之間存在著不可分割的聯系[16]。多酚是茶葉中的主要活性成分，可改善脂質代謝紊亂，高血壓和代謝綜合征，發(fā)揮類似益生元作用[17-18]，有效緩解肥胖引起的腸道菌群失調，調節(jié)短鏈脂肪酸(Short- chain fatty acids, SCFAs)水平和脂質代謝[19]。雖然之前的研究表明烏龍茶兒茶素可以在體外抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖和脂肪形成[10]，但OTP在體內的減重機制仍然未知。因此，本文采用高通量測序技術研究OTP對腸道微生物菌群結構的影響。

本文研究結果表明，OTP對宿主腸道微生物菌群的調節(jié)具有時間效應。OTP改善了HFD喂養(yǎng)誘導的腸道菌群失調。在門的水平，在試驗進行的第8周，OTP顯著降低了HFD喂養(yǎng)的小鼠的F/B比率，該比率的增加通常被認為是“肥胖腸道微生物群”標志[20]。這可能是因為多酚及其代謝物在腸道中促進Bacteroidete繁殖的同時抑制了Firmicutes的生長。茶兒茶素在某些有益細菌上表現出與低聚果糖類似的增殖作用，同時在體外抑制溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)和Clostridium的生長。此外，它促進了總SCFAs的產生[21]。SCFA的產生是腸道微生物群代謝的結果。這些SCFA被認為可以促進纖維攝入，促進結腸健康和代謝健康，而SCFA在調節(jié)宿主代謝，免疫系統(tǒng)和細胞增殖方面起著關鍵作用[22]。在我們的研究結果中，在補充OTP的HFD喂養(yǎng)的小鼠中，產生SCFA的微生物菌類Bacotoides，Blautia和Ruminococcus的相對豐度增加。此外，在第8周，OTP顯著增加了Alistipes，Barnesiella，Bifidobacteria和Lactobacillus的相對豐度，尤其是Bifidobacteria和Lactobacillus被認為是與人類健康最重要的菌群。Bifidobacteria已被證明可增強腸屏障功能，刺激宿主免疫系統(tǒng)，預防腹瀉或過敏，參與維生素激活和調節(jié)脂質代謝[23]。先前已經表明Prevotella與西方飲食中的碳水化合物比例相關，并且與慢性炎癥狀況相關[24]。在我們的研究中，隨著OTP的攝食，Prevotella的相對豐度逐漸降低，在8周時達到最低值(18.08 ± 0.03)。

綜上所述，OTP能緩解高脂飲食誘導的肥胖，降低體重和體內脂肪含量，而這可能與OTP可以提高小鼠腸道菌群多樣性和特定菌群的相對豐度有關。因此，OTP可能具有益生元活性，可用作功能性食品成分，具有治療腸道微生物群的潛在治療效用，對提高人體健康具有重要意義。