程盼盼,王翠玲,張向暉,楊春燕*,竇翠云

(濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.血液科；2.檢驗科，山東 濟寧272000)

骨髓造血微環(huán)境(包括造血干細(xì)胞、T、B、NK淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)以及腫瘤免疫逃逸在多發(fā)性骨髓瘤(MM)的發(fā)病以及疾病進展中起重要作用[1,2]。 而淋巴單核細(xì)胞比在惡性腫瘤預(yù)后評估中有重要作用[3]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測57例多發(fā)性骨髓瘤患者及30例健康志愿者淋巴、單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群(T、B、NK、NKT及CD4/8雙陰性、雙陽性T淋巴細(xì)胞)，分析多發(fā)性骨髓瘤患者淋巴/單核細(xì)胞比、以及各淋巴細(xì)胞亞群的水平以及與β2-微球蛋白和白蛋白水平的相關(guān)性，探討其在MM預(yù)后的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

以濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科2015年1月-2017年6月住院診治的57例多發(fā)性骨髓瘤患者為研究組，所有診斷均符合張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版中的國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性33例，女性24例，中位年齡61歲(60.83±9.01，37-77歲)。依據(jù)患者免疫球蛋白進行分型，IgG型27例， IgA型25例，IgD1例，輕鏈4例；依據(jù)國際ISS標(biāo)準(zhǔn)分型，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例；選取30例健康志愿者為對照，其中男性20例，女性10例，中位年齡60歲(59.27±7.51，36-71歲)。

1.2 主要試劑和儀器

CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC，CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 以及溶血素為美國BD公司，流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur，全自動生化分析儀(羅氏)，全自動血細(xì)胞分析儀(Sysmex 2100)。

1.3 實驗方法

所有觀察對象均于清晨空腹采取靜脈血，置于EDTA-K2抗凝管，用于全血細(xì)胞分析、淋巴亞群分析及檢測白蛋白和β2-MG。

1.4 淋巴亞群檢測

在BD記數(shù)管中準(zhǔn)確加入10 μl四色熒光試劑(CD3/8/45/4，CD3/16+56/45/19)和50 μl全血，充分混勻后置避光室溫孵育30 min 加入2 ml 1×CD3/8/45/4，以及CD3/16+56/45/19血液，充分混勻后室溫避光孵育10 min，300 g離心5 min，2 ml PBS 300 g離心5 min，加入450 μl PBS，24 h內(nèi)上機檢測。獲取及分析采用Cellquest軟件，檢測時，每個樣本測定管獲取淋巴細(xì)胞數(shù)10000個，分析淋巴亞群。

免疫比濁法檢測患者β2-MG，溴甲酚綠法檢測血清白蛋白水平；全自動血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞分類計數(shù)及 血紅蛋白濃度，計算淋巴單核細(xì)胞比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件包進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗， 各參數(shù)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)與正常對照相比

與正常對照相比(見表1)，MM病例組LMR減低，而淋巴細(xì)胞亞群中總T，Ts細(xì)胞較正常對照增高，其中CD4/8雙陽性及雙陰性T淋巴細(xì)胞均較正常對照組增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，B淋巴細(xì)胞較正常減低，雖然NK細(xì)胞MM組較正常組增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 相關(guān)性研究

分析淋巴單核比及各淋巴亞群與白蛋白、β2-MG的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群及Ts與白蛋白呈正相關(guān)(R=0.293，P=0.027；R=0.257，P=0.005)，CD4/8雙陰性T淋巴細(xì)胞與β2-MG正相關(guān)(R=0.442，P=0.001)，NK細(xì)胞與白蛋白呈負(fù)相關(guān)(R=-0.280，P=0.035)。見圖1-4。

表1 MM組 與正常對照組淋巴單核比以及淋巴亞群檢測值

3 討論

淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞均為機體的免疫細(xì)胞，他們通過局部免疫抑制和抑制血管生成改變了腫瘤微環(huán)境，低淋巴細(xì)胞計數(shù)被證實與不同類型癌癥患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，而高單核細(xì)胞計數(shù)是惡性腫瘤患者預(yù)后差的因素之一。淋巴/單核比(LMR)作為腫瘤患者常規(guī)進行的、經(jīng)濟便利的檢測指標(biāo)，可以早期對患者的預(yù)后做出一定程度的評估[3]。 在MM病例中，LMR可作為無進展期生存(PFS)以及總生存期的(OS)檢測指標(biāo)，Alessandra Romano等人觀察并隨訪了208例MM患者，將3.6作為LMR的最佳臨界值，發(fā)現(xiàn)初診LMR低于3.6的患者其無進展期生存要低于LMR大于3.6的患者[4]。我們結(jié)果提示MM患者LMR比健康對照要低，但沒有發(fā)現(xiàn)與白蛋白、微球蛋白相關(guān)，提示LMR與MM疾病的發(fā)病有關(guān)，但與其他指標(biāo)的相關(guān)還有待于進一步研究。

圖1CD4/8雙陰性T淋巴細(xì) 圖2T淋巴細(xì)胞與白蛋白 圖3Ts淋巴細(xì)胞與白蛋白圖4NK淋巴細(xì)胞與白蛋胞與β2-微球蛋白相關(guān)性相關(guān)性相關(guān)性白相關(guān)性

B細(xì)胞通過中和作用、調(diào)理作用、激活補體的方式介導(dǎo)機體體液免疫應(yīng)答。此外，B淋巴細(xì)胞可加工提呈可溶性抗原給T淋巴細(xì)胞，活化的B細(xì)胞還可以分泌各種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機體免疫功能。本研究結(jié)果顯示，MM 患者體內(nèi)CD19細(xì)胞的表達明顯低于正常對照組。說明MM患者機體存在體液免疫功能的低下和免疫調(diào)節(jié)功能的異常。B細(xì)胞相關(guān)抗原作為CART的靶點在MM治療中有效提示B淋巴細(xì)胞與MM的疾病進展相關(guān)[5]。有研究證實骨髓中單個核細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(Blimp1)的表達與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]，提示B淋巴細(xì)胞在MM的疾病進展中有作用。但在與白蛋白以及微球蛋白相關(guān)性研究中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，與其他指標(biāo)的相關(guān)性還有待于進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，MM伴有T淋巴細(xì)胞的表型和功能異常[7]，高鵬等人在對MM的研究中發(fā)現(xiàn)，NK、調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞以及CD8+T淋巴細(xì)胞的比例增高，B淋巴細(xì)胞、CD4/CD8比值降低[8]。在我們的研究結(jié)果中，除CD8+細(xì)胞增高，B淋巴細(xì)胞和CD4/CD8比值減低外，T淋巴細(xì)胞中CD4/8雙陽性及雙陰性T淋巴細(xì)胞比例也增高。CD4/8雙陽性T淋巴細(xì)胞雖然比例低，對其研究也少見，但是在抗病毒免疫中發(fā)揮作用，研究指出CD4/8雙陽性細(xì)胞含有記憶淋巴細(xì)胞對潛在高水平病毒感染抗原的特異效應(yīng)器[9]，而CD4/8雙陰性細(xì)胞通過穿孔素以及細(xì)胞-細(xì)胞間的作用抑制B淋巴細(xì)胞的增殖從而免疫球蛋白和抑制免疫反應(yīng)。我們的研究結(jié)果T淋巴細(xì)胞與Ts細(xì)胞與白蛋白呈正相關(guān)，提示T淋巴細(xì)胞以及Ts細(xì)胞的增高與MM的預(yù)后相關(guān)。CD4/8雙陽性以及雙陰性T淋巴細(xì)胞在MM中的作用以及對其免疫功能的影響也將是我們進一步研究的內(nèi)容。

我們的研究結(jié)果中，NK淋巴細(xì)胞比例增高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是，MM中NK淋巴細(xì)胞活性減低，研究證實，骨髓瘤細(xì)胞來源外泌體在對NK 細(xì)胞功能的抑制中起到了重要作用[10]。而我們的研究中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞與白蛋白呈負(fù)相關(guān)，也間接證實了NK淋巴細(xì)胞與MM的疾病進展相關(guān)。

綜上所述，LMR以及淋巴亞群在MM中的異常水平提示MM的免疫功能紊亂，而淋巴亞群與MM分期相關(guān)的白蛋白、β2-微球蛋白相關(guān)，提示淋巴亞群的變化與MM的預(yù)后相關(guān)。