范 潔,王 波,姜迎萍

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001)

關(guān)節(jié)炎泛指發(fā)生在人體關(guān)節(jié)及其周圍組織，由炎癥、創(chuàng)傷、感染等多種因素引發(fā)的炎性疾病[1-3]，我國關(guān)節(jié)炎患者總?cè)藬?shù)仍在逐年增加，位居自身免疫性結(jié)締組織病首位[4]，晚期導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬至變形，甚者導(dǎo)致患者殘廢，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。臨床西醫(yī)常采用非甾體抗炎藥、DMARDs及生物制劑等傳統(tǒng)治療方法[5-7]，長期服用不僅價格昂貴，且給患者帶來較大不良反應(yīng)。從中醫(yī)角度論治，本病屬“痹證”范疇，又在文獻(xiàn)中被描述為“尪痹”“頑痹”“歷節(jié)”“痛風(fēng)”“骨槌風(fēng)”等[8]，近年來關(guān)于針灸醫(yī)治關(guān)節(jié)炎動物研究進(jìn)展迅速，為臨床治療關(guān)節(jié)炎、緩解病癥、提高患者生存質(zhì)量并降低不良反應(yīng)等方面提供理論依據(jù)。另一方面，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展是由一系列細(xì)胞因子的變化所引起的炎癥反應(yīng)積聚病變，而針灸腧穴可能通過抑制TNF、IL-1等炎癥因子的釋放發(fā)揮抗炎免疫作用[9-10]，因此，本研究基于佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察針刺對模型鼠炎性因子表達(dá)、抗炎免疫及抗炎鎮(zhèn)痛反應(yīng)的作用，為中醫(yī)針灸治療關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

弗氏完全佐劑(美國西格瑪奧德里奇公司)；華佗牌0.25 mm×13 mm不銹鋼針灸毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；NO、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠IL-1、TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海北諾生物科技有限公司)；冰乙酸(分析純，天津廣成化學(xué)試劑有限公司)；泰盟PL-200型熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 實驗動物和分組干預(yù)

1.2.1 實驗動物 無特定病原體(SPR)級Wister大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，實驗動物購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h恒溫(25±1)℃、恒濕50%～70%,晝夜節(jié)律交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后正式開始實驗，實驗操作嚴(yán)格遵守動物倫理保護(hù)法等相關(guān)規(guī)定。

1.2.2 實驗分組及造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)將大鼠分為正常組、模型組和針刺組，每組10只。模型組和針刺組大鼠采用5%水合氯醛以0.8 mL/100 g濃度比例腹腔注射麻醉，取弗氏完全佐劑0.1 mL，對大鼠右后足跖底部采用75%酒精消毒3遍，將佐劑皮內(nèi)注射至踝關(guān)節(jié)處，模擬關(guān)節(jié)炎模型。以24 h內(nèi)出現(xiàn)右側(cè)足部急性炎癥腫脹，48 h內(nèi)全身出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎為標(biāo)志，觀察造模后3天大鼠前肢或?qū)?cè)肢體紅腫及炎癥結(jié)節(jié)出現(xiàn)情況，出現(xiàn)上述情況則視為造模成功。正常組大鼠不做任何處理。

1.2.3 治療方法 判定造模成功后隔日將針刺組大鼠呈俯臥位束于固定器中，外展拉直并固定四肢，局部剃毛處理。75%酒精消毒皮膚3次，用棉棒蘸取碘伏分別在足三里、陽陵泉和昆侖穴3處標(biāo)記，穴位標(biāo)記參照林文注主編的《實驗針灸學(xué)》[11]圖譜定位，取13 mm長毫針迅速刺入大鼠上述3處穴位中10 mm，留針30 min后出針，再次消毒后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件不變。2天施針1次，3周后結(jié)束治療。正常組及模型組大鼠不做任何處理。

1.3 大鼠行為學(xué)實驗

1.3.1 大鼠醋酸扭體反應(yīng)實驗 最后1次針刺治療結(jié)束后1 h，以0.2 g/kg比例給予各組大鼠1%冰醋酸腹腔注射，醋酸溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。注射完成后將大鼠放于空曠飼養(yǎng)籠中，計時10 min觀察并記錄大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)，其中扭體反應(yīng)包括：蠕行、腹部收縮內(nèi)凹、后肢伸展及臀部抬高等。

1.3.2 熱板致痛實驗 醋酸扭體反應(yīng)實驗結(jié)束后平靜大鼠恢復(fù)至正常狀態(tài)，1～2 h后將各組大鼠置于熱板上加熱保持溫度在(55.0±0.5)℃，觀察并記錄1 min內(nèi)大鼠從接觸熱板到舔后足的時間，1 min內(nèi)無明顯疼痛反應(yīng)產(chǎn)生則取出大鼠終止實驗，以上述記錄的時間作為各組大鼠的痛閾值。

1.4 血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量檢測

實驗治療3周后5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，行仰臥位固定大鼠經(jīng)腹主動脈采血3 mL，靜置沉淀1 h后4 000 r/min低速離心10 min，分離上層血清，參照NO、SOD、MDA檢測試劑盒說明書分別采用硝酸還原酶法、羥胺法及硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清內(nèi)NO、SOD、MDA含量變化。

1.5 大鼠免疫器官系數(shù)檢測

完成上述行為學(xué)實驗后稱重記錄大鼠體質(zhì)量(g)，頸椎脫臼處死大鼠，分別取大鼠脾臟、胸腺及炎癥病變組織標(biāo)本，炎癥病變組織標(biāo)本稱重后快速降溫置于液氮中冷凍保存。胸腺及脾臟新鮮稱取濕重，記為臟器質(zhì)量(mg)，以計算胸腺、脾系數(shù)，公式如下：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 HE染色觀察大鼠滑膜組織病理學(xué)狀態(tài)

參考文獻(xiàn)方法，取各組大鼠關(guān)節(jié)完整滑膜組織，4%多聚甲醛固定液4℃浸泡固定過夜，行常規(guī)石蠟包埋及切片，經(jīng)蘇木素伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜組織病理學(xué)改變情況。

1.7 大鼠組織炎性因子表達(dá)測定

取凍存的炎癥病變組織融化后加入1 mL預(yù)冷的PBS冰浴充分勻漿，2 500 r/min低速離心20 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，參照雙抗夾心ELISA法檢測取適量組織上清液于檢測板孔內(nèi)，檢測各組大鼠肌肉組織中IL-1、TNF-α表達(dá)差異。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 滑膜組織病理變化比較

HE染色觀察大鼠后肢關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化，如封三彩圖1所示，光鏡下正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核分布有序，無明顯病變。模型組大鼠滑膜組織區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，部分可見細(xì)胞壞死，同時出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，組織水腫伴隨嚴(yán)重纖維壞死，由此可說明佐劑關(guān)節(jié)炎模型造模成功。給予針刺治療3周后，可見滑膜組織細(xì)胞病變有一定程度的改善，滑膜組織略增厚，細(xì)胞邊緣少見不平整，局部殘有炎性細(xì)胞浸潤，整體組織結(jié)構(gòu)基本完整，針刺后改善大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)。

2.2 3組大鼠醋酸扭體反應(yīng)次數(shù)和熱板反應(yīng)時間比較

與正常組相比，模型組大鼠醋酸扭體反應(yīng)明顯(P<0.05)；給予針刺治療后，針刺組大鼠醋酸扭體反應(yīng)顯著低于模型組(P<0.05)，且與正常組大鼠無顯著性差異。模型組大鼠痛閾值顯著低于正常組(P<0.05)；給予針刺治療后，大鼠痛閾值有明顯的改善，針刺組較模型組顯著提高(P<0.05)，但仍低于正常組(P<0.05)。詳見表1。

表1 針刺治療對大鼠醋酸扭體反應(yīng)和熱板反應(yīng)的影響

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.3 3組大鼠血清NO、SOD、MDA含量比較

ELISA檢測3組大鼠血清中NO、SOD、MDA含量變化，驗證抗自由基損傷作用。如表2所示，模型組較正常組大鼠血清NO、MDA含量顯著升高，血清SOD顯著降低(P<0.05)。給予針刺治療后，以上指標(biāo)較模型組明顯改善(P<0.05)。

表2 針刺治療對大鼠血清內(nèi)NO、SOD、MDA含量的影響

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.4 3組大鼠免疫器官系數(shù)比較

模型組大鼠胸腺系數(shù)較正常組顯著降低，脾系數(shù)較正常組大鼠顯著升高(P<0.05)；給予針刺治療后，針刺組大鼠脾系數(shù)較模型組顯著升高，而胸腺系數(shù)較模型組顯著降低(P<0.05)，詳見表3。

表3 針刺治療對大鼠免疫器官系數(shù)的影響

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.5 3組大鼠肌肉病變組織IL-1、TNF-α含量比較

如表4可見，模型組大鼠肌肉病變組織中IL-1、TNF-α含量均較正常組存在顯著性差異(P<0.05)；針刺干預(yù)在一定程度緩解模型大鼠炎性因子表達(dá)量，病變區(qū)域組織內(nèi)IL-1、TNF-α含量較模型組顯著降低(P<0.05)。

表4 針刺治療對大鼠炎癥組織IL-1、TNF-α含量變化的影響

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

3 討論

關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，我國中醫(yī)認(rèn)為該病源于正虛邪侵，虛實夾雜，正氣虛損，腠理不固，致使風(fēng)寒濕熱之邪乘虛而入，壅塞經(jīng)絡(luò)，久而為痹[12]，同時現(xiàn)代研究表明，針灸可通過發(fā)揮抗炎效應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、影響神經(jīng)遞質(zhì)及自由基調(diào)控鎮(zhèn)痛等途徑對關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生治療作用[13]。本實驗取足三里、陽陵泉和昆侖穴3處。陽陵泉穴，為膽經(jīng)之合穴、膽之下合穴，《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》記載其具有“治膝伸不得屈，冷痹腳不仁”的作用；足三里為足陽明胃經(jīng)之穴，燥化脾濕，生發(fā)胃氣，作為膀胱經(jīng)的經(jīng)穴，能治療經(jīng)脈循行所過之處的疾病，《靈樞·四時氣》記載:“著痹不去，久寒不已，率取其三里”；昆侖穴[14]為足太陽膀胱經(jīng)的經(jīng)穴，針灸昆侖穴可通利經(jīng)脈氣血，可奏通則不痛之效，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用。由此，以針刺施治上述穴位，進(jìn)一步探究中醫(yī)針灸對模型大鼠炎性因子水平、抗炎免疫及抗炎鎮(zhèn)痛反應(yīng)的作用。

HE染色觀察大鼠后肢關(guān)節(jié)滑膜組織病變結(jié)果顯示，針刺治療后實驗組大鼠較模型組大鼠滑膜組織病理改變得到緩解，關(guān)節(jié)處細(xì)胞排列較為規(guī)則，有清晰的細(xì)胞形態(tài)，同時炎性細(xì)胞浸潤情況減少。IL-1、TNF-α的積聚表達(dá)可進(jìn)一步刺激并加速軟骨破壞和局部組織纖維增生，誘發(fā)機(jī)體效應(yīng)器發(fā)生急性期反應(yīng)，最終導(dǎo)致炎性爆發(fā)[15-16]。在本研究中針刺干預(yù)3周后，實驗組大鼠肌肉組織中IL-1、TNF-α含量較模型組顯著降低，提示針刺施治足三里等穴可能通過降低IL-1、TNF-α等炎癥因子趨化反應(yīng)阻斷其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。由此，進(jìn)一步通過檢測針刺對免疫器官系數(shù)的影響和抗自由基損傷作用。臟器系數(shù)尤其胸腺及脾臟系數(shù)是衡量動物體免疫功能的重要直標(biāo)，該值增大表示臟器可能存在充血、水中或增生的異?，F(xiàn)象，而系數(shù)降低則暗示動物體可能出現(xiàn)臟器萎縮及其他退行性改變，在本實驗中，模型組大鼠胸腺系數(shù)顯著降低，針刺則能治療關(guān)節(jié)炎模型造成的胸腺系數(shù)降低的情況，而胸腺是分泌產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和胸腺素的重要器官，該臟器指數(shù)在一定程度上預(yù)示著動物體免疫功能的強(qiáng)弱，由此進(jìn)一步驗證了針灸施治足三里、陽陵泉和昆侖穴能促進(jìn)胸腺功能恢復(fù)從而促進(jìn)機(jī)體抗炎免疫的進(jìn)程。另一方面，NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)不僅直接參與關(guān)節(jié)損傷過程，其在體內(nèi)的積聚更會加劇炎性級聯(lián)反應(yīng)[17]，同時，動物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)誘導(dǎo)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的積聚，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，對大鼠的炎性反應(yīng)及生存狀態(tài)產(chǎn)生重要影響，在本實驗中針刺能夠顯著抑制體內(nèi)NO及MDA的積聚，同時促進(jìn)超氧化物歧化酶(SOD)含量上升，起到清除體內(nèi)自由基積聚、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用，作用促進(jìn)關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗自由基損傷作用和細(xì)胞毒性抑制，進(jìn)一步減輕免疫炎癥并弱化疼痛反應(yīng)的發(fā)生。最后通過醋酸致大鼠扭體實驗及熱板致痛實驗進(jìn)一步驗證大鼠痛閾值及疼痛反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)生次數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)針刺施治足三里、陽陵泉、昆侖穴可以顯著改善大鼠疼痛反應(yīng)發(fā)生并較模型組痛閾值有一定程度的提升，針刺促進(jìn)關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎鎮(zhèn)痛反應(yīng)效果增加。

綜上，本研究證實了針刺施治足三里、陽陵泉、昆侖穴3穴可有效地改善大鼠炎性因子表達(dá)水平、促進(jìn)抗炎免疫及抗炎鎮(zhèn)痛反應(yīng)發(fā)生，其機(jī)制可能與足三里健脾益氣、昆侖穴消腫止痛、陽陵泉通經(jīng)散瘀等作用有關(guān)，三者相輔相成，抑制炎證級聯(lián)反應(yīng)、促進(jìn)抗炎物質(zhì)分泌，共同介導(dǎo)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終起到治療緩解關(guān)節(jié)炎癥的作用，為臨床針灸施治關(guān)節(jié)炎提供了有力的科學(xué)依據(jù)。