丁澤紅 吳春來 顏彥

摘要：海藻糖-6-磷酸酯酶（TPP）負責海藻糖生物合成催化反應的最后一步，是植物海藻糖生物合成途徑的關鍵酶。采用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個TPP基因，命名為MeTPP6，該基因含有1個1 122 bp的開放閱讀框，編碼373個氨基酸，具有TPP家族保守結構域。系統(tǒng)進化樹分析表明，MeTPP6與杞柳和楊樹中同源基因的親緣關系較近，序列相似性高達89.7%和89.0%。啟動子分析表明，MeTPP6含有干旱、低溫、熱脅迫、激素（如ABA）和光響應等相關元件。熒光定量PCR分析表明，MeTPP6在葉片和葉柄中表達量最低;在須根和儲藏根中表達量最高，分別為葉片表達量的4.2倍和4.5倍。而且，MeTPP6基因的表達能被干旱、低溫和ABA處理顯著誘導。這些結果表明，MeTPP6通過依賴于ABA的信號通路在轉錄水平參與木薯干旱和低溫脅迫，可作為重要候選基因進一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科熱帶地區(qū)重要的薯類作物，具有高產(chǎn)、高淀粉和耐貧瘠等特性，在現(xiàn)代農業(yè)和工業(yè)中占有非常重要的地位。木薯是一種耐旱作物，一方面木薯可以通過調節(jié)氣孔開閉以及新展開葉片的表面積大小來減少蒸騰作用造成的水分損失;另一方面，木薯具有發(fā)達的根系，可以從深層（>2 m）土壤中吸收水分[1]。然而，在較長時間或較為嚴重的干旱條件下，其塊根產(chǎn)量仍會顯著下降[2]。作為典型的熱帶作物，木薯主要種植在30°S至30°N之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)。與其抗旱性相比，木薯對低溫非常敏感，在<14 ℃時木薯生長比較緩慢，<10 ℃時木薯將停止生長。更嚴重的是，極端的低溫氣候可以造成木薯大幅減產(chǎn)甚至絕收[3]。因此，提高木薯對干旱和低溫等脅迫的抗性，使其在不良生長環(huán)境下減少產(chǎn)量損失或是維持原有產(chǎn)量具有重要意義。

海藻糖是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖質，在真菌、細菌、藻類、和動植物中廣泛存在[4]。研究表明，在干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫條件下，植物體內海藻糖含量會大量積累[5]，植物生物抗性顯著增強。因此，提高海藻糖含量的累積對植物抵御干旱、低溫等逆境脅迫非常重要。植物中海藻糖主要經(jīng)TPS/TPP途徑合成，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖分別在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，簡稱TPS）、海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，簡稱TPP）的催化作用下生成海藻糖[6]。不難看出，TPP負責海藻糖生物合成催化反應的最后一步，是植物海藻糖生物合成途徑的1個關鍵酶。

植物中TPP由多基因編碼，例如水稻中有13個TPP基因（OsTPP1-OsTPP13）[7]，擬南芥中有10個TPP基因（AtTPPA- AtTPPJ）[8-9]，它們都含有TPP基因家族保守結構域。早在2005年，Pramanik 等從水稻中克隆了OsTPP1基因，瞬時表達表明OsTPP1受到低溫、干旱、鹽和外源脫落酸（ABA）誘導，而且低溫處理后同時提高了TPP活性和海藻糖含量[10]。將OsTPP1基因在水稻中超表達后，轉基因植株對鹽和低溫的耐受性增強[7]。進一步功能分析表明，OsTPP1可以激活脅迫相關基因的表達，從而增強轉基因植株的抗逆性[7]。重要的是，Nuccio等將OsTPP1基因在玉米中超表達后，多年份多地點田間試驗表明，轉基因植株在正常和干旱條件下均可以增加玉米產(chǎn)量[11]。由此可見，OsTPP1是1個重要的作物抗逆遺傳改良的候選基因。另1個水稻TPP基因OsTPP7，最近被證明通過糖代謝調控增強水稻厭氧萌發(fā)的耐受性[12]。在擬南芥中，Vogel等通過酵母互補試驗鑒定并克隆了2個擬南芥TPP基因AtTPPA和AtTPPB[13]。研究發(fā)現(xiàn)，AtTPPA和AtTPPB表達后可以互補tps2突變體的功能，并能夠在體內（in vivo）和體外（in vitro）試驗中檢測到TPP活性[13]。此外，擬南芥TPP基因家族成員的表達也受到低溫、干旱、鹽和ABA處理的調控[9]。

然而，目前這些研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中，在熱帶作物（如木薯）中尚沒有關于TPP基因克隆及其響應非生物脅迫的研究報道。本研究采用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個TPP基因（命名為MeTPP6），分析其保守結構域、系統(tǒng)進化樹和啟動子元件，并通過qRT-PCR分析了其在不同組織中以及在干旱、低溫和外源ABA處理下的表達水平，旨在為進一步研究MeTPP6在木薯非生物逆境響應中的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為木薯主推栽培品種Ku50，具有高淀粉、抗逆性好等特點，由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供。植物RNA提取試劑盒（貨號：DP437）購自天根生化科技有限公司，cDNA反轉錄試劑盒（貨號：K1622）購自Fermentas 公司。本研究中PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 木薯種植與處理

按照丁澤紅等方法[14]進行木薯種植。將Ku50種莖切成15 cm左右的莖段，選擇粗細均勻且含有3～4個芽眼的莖段種植于塑料盆（上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm，高18.8 cm），每盆種植1個莖段。將蛭石和營養(yǎng)土按照1 ∶ 1的體積比混合后作為木薯基質。種植約10 d后對木薯進行間苗，每盆只保留1棵苗。試驗時間為2013年5月，試驗地點為中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。木薯種植60 d后，分別進行低溫、干旱和ABA處理。（1）低溫處理：將生長狀況一致的植株放置于光照培養(yǎng)箱，進行4 ℃低溫脅迫處理。在處理0、6、24 h 后，分別收集第1張完全展開葉、未展開葉和根的樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?）干旱處理：采用PEG-6000進行干旱模擬處理。處理植株澆灌20%的PEG-6000溶液，對照植株不施PEG（采用澆灌自來水代替）。在處理0、3和24 h 后，分別收集第1張完全展開葉、未展開葉、老葉和根的樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?）ABA處理：采用 100 μmol/L ABA溶液進行澆灌處理，在處理0、3、5、7 d 后收集第1張完全展開葉的樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了研究不同組織中MeTPP6基因的表達情況，還收集了正常種植條件下木薯Ku50的根（包括須根和儲藏根）、莖、葉和葉柄的樣本，用于qRT-PCR分析。

1.3 引物合成及qRT-PCR

1.4 生物信息學分析

參照丁澤紅等方法[14]進行生物信息學分析，具體描述如下：用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲取其他物種中與MeTPP6同源的蛋白質序列;用ExPASy ProtParam計算蛋白質的等電點和分子量;用Plant-mPLoc預測亞細胞定位;用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫預測保守結構域;用ClustalX進行序列比對;用MEGA 5.2構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹;用PlantCARE分析啟動子元件;用Primer 5.0軟件設計PCR引物。

2 結果與分析

2.1 MeTPP6基因克隆

在前期木薯轉錄組數(shù)據(jù)中獲得了1個在干旱脅迫下差異表達基因（cassava4.1_009931m.g），之后根據(jù)Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫提供的參考序列，設計引物進行PCR擴增、凝膠電泳檢測（圖1）。經(jīng)測序后獲得1條全長為1 122 bp的序列，編碼373個氨基酸（圖2），根據(jù)其與水稻TPP基因的同源性將其命名為MeTPP6。序列比對發(fā)現(xiàn)，MeTPP6與參考序列之間僅存在1個堿基差異，可引起氨基酸編碼的改變。ProtParam預測MeTPP6蛋白的分子式為C1 876H2 988N510O544S14，總原子數(shù)目為5 932，理論等電點（pI值）為9.31，分子量為 41 840.3 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為27.48，屬于穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位預測該蛋白質定位于液泡或葉綠體。NCBI-CDD保守結構域分析表明，MeTPP6編碼的蛋白含有TPP基因家族保守結構域（Trehalose_PPase）（圖2），屬于木薯TPP基因家族成員。

2.2 MeTPP6系統(tǒng)進化樹分析

通過BlastP工具在線搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫獲取與MeTPP6同源性較高的其他物種中的蛋白質序列，構建系統(tǒng)進化樹。聚類后發(fā)現(xiàn)，這些基因可以分為3組（圖3）：第Ⅰ組包括許多C4植物，如小米、狗尾草、黍羊Panicum hallii、柳枝稷、玉米、高粱和二穗短柄草;水稻TPP基因也被聚類在第Ⅰ組，它與二穗短柄草的同源基因親緣關系較近，序列相似度高達87.8%。木薯MeTPP6基因被聚類在第Ⅱ組，它與杞柳（SapurV1A.0684s0130.1）和楊樹（Potri.005G077200.1）中同源基因的親緣關系較近，序列相似性分別為89.7%和89.0%。擬南芥TPP基因被聚類在第Ⅲ組，同時還包含了其他十字花科的物種，如白菜型油菜、薺菜花、琴葉擬南芥和鼠耳芥等。

2.3 MeTPP6基因啟動子分析

啟動子對基因表達起重要調控作用，它決定著基因的轉錄起始和表達程度。本研究選取MeTPP6起始密碼子上游 1 500 bp 的序列進行啟動子分析，發(fā)現(xiàn)了許多與逆境響應相關的元件，如干旱誘導元件MBS、低溫響應元件LTR、低溫和干旱響應元件C-repeat/DRE、熱脅迫響應元件HSE以及防御與脅迫相關元件TC-rich repeats（表1）。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了許多與激素響應相關的元件，如水楊酸響應元件TCA-element、茉莉酸響應元件TGACG-motif和CGTCA-motif、赤霉素響應元件P-box和GARE-motif、脫落酸（ABA）響應元件ABRE，以及許多與光響應相關的元件，包括MRE、ACE、G-Box、Sp1和box II等。這些研究結果表明，MeTPP6可能參與木薯干旱、低溫、高溫、激素和光響應相關的基因表達調控。

2.4 MeTPP6在木薯不同組織中的表達分析

TPS基因的表達量在植物不同組織器官中存在較大差異。本研究考察了MeTPP6基因在木薯Ku50不同組織中的表達情況，結果表明，MeTPP6在葉片和葉柄中表達量最低;莖中表達量較高，約為葉片中表達量的2.1倍;須根和儲藏根中表達量最高，分別為葉片中表達量的4.2倍和4.5倍（圖4）。這些結果表明，MeTPP6基因主要在木薯的須根和儲藏根中起作用。

2.5 MeTPP6在不同脅迫條件下的表達分析

本研究在MeTPP6基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了干旱、低溫和ABA響應相關的元件。為了進一步驗證MeTPP6的功能，本研究分別在干旱、低溫和ABA處理條件下考察了MeTPP6基因的表達模式（圖5）。

在PEG-6000脅迫條件（模擬干旱）下，在處理3、24 h后MeTPP6在老葉中的表達量呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢，但表達量無顯著差異;在第1張完全展開葉中，MeTPP6的表達量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，在處理3、24 h后分別下降了19%和上升了1.3倍;在未展開葉，MeTPP6的表達量呈現(xiàn)先不變后上升的變化趨勢，在處理24 h后上升了1.8倍;在根中，MeTPP6的表達量呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢，在處理3、24 h后分別上升了1.3倍和1.5倍（圖5-A）。

在低溫脅迫下，在未展開葉和第1張完全展開葉，MeTPP6的表達量在處理6、24 h后均呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢，其表達量分別下降了56%和64%、49%和65%;不同的是，根中MeTPP6的表達量在處理6、24 h后呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢，其表達量分別上升了3.8倍和8.1倍（圖5-B）。

在ABA處理條件下，MeTPP6在葉片中的表達量顯著上升了，在處理3、5、7 d后分別上升了1.4倍、1.7倍、1.9倍（圖5-C）。

這些結果充分表明，MeTPP6基因在轉錄水平參與干旱、低溫和ABA處理響應，可作為候選基因進一步研究其在木薯抗逆中的功能。

3 討論與結論

海藻糖是重要的滲透調節(jié)物質，提高植物體內海藻糖含量可以增強植物對干旱、低溫等非生物脅迫的抗性[16]。TPS和TPP是海藻糖生物合成途徑中的關鍵酶。與TPS相比，有關植物TPP基因克隆的研究還很少，且大多數(shù)報道都集中在模式植物擬南芥和水稻中。擬南芥中共有10個TPP基因，水稻中有13個TPP基因，它們都含有TPP基因家族保守結構域[7-8]。研究表明，提高TPP基因的表達量可以增強植物對逆境脅迫的抗性。在擬南芥中超表達AtPPD基因后，轉基因植株抗鹽能力增強[17];在水稻中超表達OsTPP1基因后，轉基因植株中OsTPP1表達量上升，其對低溫、鹽和干旱脅迫的抗性增強[7，10]。進一步試驗表明，ABA代謝參與OsTPP1基因的表達調控[10]。而且，在玉米中超表達OsTPP1基因后發(fā)現(xiàn)，在正常和干旱條件下均可以增加玉米產(chǎn)量[11]?？梢?，TPP是1個非常重要的抗逆候選基因，可用于作物抗逆遺傳改良育種。本研究通過RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個TPP基因MeTPP6，序列分析表明MeTPP6編碼373個氨基酸，含有TPP基因家族保守結構域，屬于木薯TPP基因家族成員。進化樹分析表明，它與杞柳和楊樹中TPP基因的親緣關系較近，序列相似性分別為89.7%和89.0%。

TPP基因在不同組織中的表達具有較大差異。例如擬南芥AtTPPA、AtTPPF和AtTPPG主要在花粉表達，AtTPPB主要在胚根、側根以及根的伸長區(qū)表達，而AtTPPE主要在子葉和木質部表達[9]，暗示不同TPP成員可能傾向于在不同組織中發(fā)揮功能。本研究發(fā)現(xiàn)MeTPP6在葉片和葉柄中表達量最低，在須根和儲藏根中表達量最高，支持MeTPP6基因主要在木薯的須根和儲藏根中起作用。

TPP基因表達受到低溫、干旱、鹽、機械損傷和滲透脅迫等調控，且不同TPP成員對各種處理的響應不一樣。例如，在擬南芥幼苗中，AtTPPE、AtTPPF、AtTPPG和AtTPPJ的表達均受到低溫、鹽和滲透脅迫的誘導，AtTPPA和AtTPPH的表達僅受到低溫脅迫誘導但被鹽和滲透脅迫抑制[9]。在根中，AtTPPD、AtTPPF和AtTPPI的表達均受到低溫、鹽和滲透脅迫的誘導;AtTPPA、AtTPPE和AtTPPG的表達受到低溫和鹽脅迫的誘導，但對滲透脅迫表現(xiàn)出不同的響應模式;而AtTPPB和AtTPPH的表達則受到低溫、鹽和滲透脅迫的抑制[9]。此外，不同TPP成員對激素的響應也不一樣。AtTPPA和AtTPPB的表達受到ABA處理抑制，AtTPPI和AtTPPD的表達受到ABA處理誘導，而AtTPPE、AtTPPG和AtTPPF的表達則同時受到ABA和JA處理誘導[9]。水稻中OsTPP1基因的表達也受到低溫、干旱、鹽和外源ABA激素的誘導[7，10]。本研究在MeTPP6啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一系列與干旱、低溫、防御和脅迫響應相關的元件，表達分析也進一步證實，MeTPP6基因的表達量受到干旱和低溫的調控。植物響應外界非生物脅迫的信號路徑主要分為依賴于ABA信號通路和不依賴于ABA信號通路2種[18]。本研究在MeTPP6啟動子區(qū)域多個位置發(fā)現(xiàn)了與ABA響應相關的元件ABRE，且表達分析結果也表明MeTPP6基因表達是響應ABA信號的。因此，本研究推測MeTPP6可能是通過依賴于ABA的信號通路參與木薯干旱和低溫等非生物脅迫調控。這些結果將為進一步研究MeTPP6基因在木薯抗逆中的功能提供理論參考。

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