羅靖瑩，郭 陽，黃瑋瑋，黃曉波

0 引 言

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是嚴重威脅重患者生命的臨床常見疾病。ARDS是重癥醫(yī)學科中導致患者死亡的主要原因［1］，其病死率仍高達30%～40%［2］。肺微血管內(nèi)皮細胞是ARDS失控炎癥反應的受害者，也是啟動者。因為缺乏組蛋白的保護，線粒體DNA很容易受到損傷。在內(nèi)皮細胞中，內(nèi)毒素、炎癥因子和氧化應激物都能使線粒體膜的鈣泵失活［3-4］，因此對受損線粒體的修復至關重要。細胞移植為很多危重癥疾病的治療提供了可能，MSC是成體干細胞的一種，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是理想的外源性修復種子細胞來源［5］。已有大量文獻研究證實MSC可以有效減輕肺損傷［6］，外源性MSC可以通過直接與損傷細胞融合或者通過旁分泌機制參與肺損傷免疫炎癥反應調(diào)控［7］，線粒體可以通過MSC的納米管或者微泡進行細胞間的轉(zhuǎn)移［8］。因此我們推測MSC主要是通過轉(zhuǎn)移有活性的線粒體來促進損傷肺微血管內(nèi)皮細胞的修復，從而發(fā)揮減輕肺損傷作用的。本研究主要通過寡霉素抑制線粒體功能，以此來探究線粒體對ARDS肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）、小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）（Sciencell公司），DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；抗CYP1A1、CYP1A2、eNOS、iNOS、VE-cadherin，β-actin（R&D 公司），Goat anti-rabbit IgG-HRP、Goat anti-mouse IgG-HRP（Abcam 公司），Mito-tracker Red、Mito-tracker green（Thermofisher公司），活性氧試劑盒、JC-1膜電位試劑盒（碧云天公司），F(xiàn)ITC-dextran、dextran（seebio公司），共聚焦熒光顯微鏡（leica公司），細胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司），離心機（Beckman公司），熒光酶標儀（Thermo公司），流式細胞儀（Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)MSCs和PMVECs均用含10%胎牛血清和5%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。使用膠原酶包被的孔徑為0.4μm的transwell小室建立共培養(yǎng)體系。

1.2.2 線粒體功能抑制向MSCs培養(yǎng)基中加入3μg/mL的寡霉素（oligomycin，oli）［9］，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，以此抑制線粒體的有氧呼吸，同時應向培養(yǎng)基內(nèi)加入50μg/mL的尿苷和2.5 mmol/L的丙酮酸鈉以此補充糖酵解所需的因子。48 h后用PBS洗滌3次后，得到線粒體功能抑制的MSC。

1.2.3 線粒體轉(zhuǎn)移為直觀評估MSCs向PMVECs轉(zhuǎn)移線粒體，用200 nmol/L MitoTracker紅色染料染PMVECs的線粒體20 min，mito-green綠色染料染MSC的線粒體，兩者共培養(yǎng)24 h后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 葡聚糖滲漏試驗檢測內(nèi)皮細胞通透性測量內(nèi)皮細胞的通透性時，Transwell小室上層加入1×104個PMVECs以及100μL 10 mg/mL相對分子質(zhì)量40 000 FITC-dextran，下層加入5×104個MSCs以及等濃度的不含熒光的dextran。40 min后吸取雙層小室頂層和底層液體各100μL，置于黑色不透光96孔板中，用熒光酶標儀測激發(fā)光波長490/485 nm，發(fā)射光波長525/530 nm，測量樣品的熒光強度內(nèi)皮細胞通透系數(shù)，公式如下［9］：

內(nèi)皮細胞通透系數(shù)=［A］／t×1／A×v／［L］

其中［A］為下室熒光蛋白濃度，t為時間，以秒表示；A為濾過面積，以cm2表示；v為下室液體量；［L］為上室熒光蛋白濃度。

1.2.5 Western blot檢測檢測線粒體相關蛋白，內(nèi)皮細胞的合成功能及連接功能相關蛋白。通過細胞裂解液分離提取得到蛋白，BCA蛋白定量后，通過SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)樣品（40μg）并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。 使用抗CYP1A1、CYP2A2、eNOS、iNOS、VE-cadherin和β-action與5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h。膜與一抗在4℃溫育過夜后，用Tween洗膜10 min，并與二抗孵育2 h。通過化學發(fā)光（ECL）系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)的表達水平，β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 活性氧檢測使用碧云天活性氧檢測試劑盒。向各組PMVECs中加入10μmol/L的DCFHDA，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，收集細胞后用熒光分光光度計檢測在488 nm/525 nm處的熒光強度。

1.2.7 線粒體膜電位（JC-1）檢測使用碧云天線粒體膜電位檢測試劑盒。取10～60萬PMVECs，重懸于細胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結束后，600×g4℃離心3～4 min，沉淀細胞，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光分光光度計檢測單體（490/530）和聚合物（525/590）的熒光比值。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI用不含EDTA的胰酶消化PMVECs后，300×g，4℃離心5 min收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300×g，4℃離心5 min。收集1～5×105細胞。吸棄PBS，加入100μL緩沖液（1×）重懸細胞。加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色液，輕輕混勻。避光、室溫反應10～15 min。加入400μL緩沖液（1×），混勻后放置于冰上，用流式細胞儀檢測。

1.3 實驗分組實驗分為對照組、LPS組、MSC組和MSC-oli組。對照組：上層加入1×104個PMVEC以及完全培養(yǎng)基；LPS組：上層加入1×104個PMVEC以及含100 ng/mL的LPS的完全培養(yǎng)基；MSC組：上層加入 1×104個 LPS 干預的 PMVECs，下層加入 5×104個的MSCs，共培養(yǎng)24 h。 MSC-oli組：上層加入1×104個 LPS 預干預的 PMVECs，下層加入 5×104個寡霉素預處理的MSCs（MSC-oli），共培養(yǎng)24 h。

1.4 統(tǒng)計學分析用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時，組間兩兩比較采用LSD檢驗，每個實驗結果均重復3次，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熒光染色將PMVEC中的線粒體用紅色熒光預染，與MSC、MSC-oli的線粒體用綠色熒光預染，分別染色后共培養(yǎng)后，兩組共在共聚焦顯微鏡下均可觀察到PMVECs中存在綠色熒光MSC及MSC-oli的線粒體均可以向PMVECs轉(zhuǎn)移，說明MSC、MSC-oli的線粒體均可向PMVECs中轉(zhuǎn)移，且在共聚焦顯微鏡下直觀可見但MSC組較MSC-oli組向PMVECs中轉(zhuǎn)移了更多的線粒體，見圖1。

圖1 共聚焦鏡下觀察線粒體轉(zhuǎn)移Figure 1 The transmission of mitochondria under confocal microscopy

2.2 線粒體蛋白含量Western blot檢測顯示，與對照組比較，LPS組、MSC-oli組CYP1A1和CYP1A2蛋白表達均降低（P＜0.05）；與LPS組比較，MSC組CYP1A1和 CYP1A2表達增加（P＜0.05）；MSC組CYP1A1和 CYP1A2表達較 MSC-oli組增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 線粒體相關蛋白CYP1A1和CYP1A2的表達Figure 2 The expression of mitochondrial related proteinCYP1A1 and CYP1A2

2.3 內(nèi)皮細胞合成功能LPS組較對照組iNOS的表達明顯增加，而eNOS明顯減少（P＜0.05）。MSC組較LPS組iNOS的表達水平明顯下降（P＜0.05），eNOS表達水明顯增加（P＜0.05）。MSC-oli組較MSC組iNOS表達明顯增加，eNOS表達明顯降低（P＜0.05），見表1。

2.4 內(nèi)皮細胞間連接與對照組比較，LPS組中VE-cadherin的表達降低（P＜0.05），MSC組、MSC-oli組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.5 內(nèi)皮細胞通透性葡聚糖滲漏實驗檢測PMVECs通透性結果顯示，在LPS刺激PMVECs損傷后，內(nèi)皮細胞的通透性明顯升高（P＜0.05）。MSC組較 LPS組通透性明顯降低（P＜0.05）。MSC-oli組較 MSC組通透性明顯增高（P＜0.05），但 較 LPS組 差 異 無 統(tǒng) 計 學 意 義（P＞0.05）。見表1。

2.6 細胞凋亡與對照組比較，LPS組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；MSC組凋亡率較LPS組明顯下降（P＜0.05），MSC-oli組凋亡率較MSC組明顯升高（P＜0.05）。見表 1，圖 3。此外，LPS組的PVMECs膜電位較對照組明顯降低（P＜0.05）；MSC組的膜電位較LPS組明顯升高（P＜0.05）；MSC-oli組的線粒體膜電位較MSC組顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組間內(nèi)皮細胞相關功能的比較（±s）Table 1 The function of PMVECs in different groups（± s）

表1 各組間內(nèi)皮細胞相關功能的比較（±s）Table 1 The function of PMVECs in different groups（± s）

與對照組比，*P＜0.05；與LPS組比，#P＜0.05；與MSC組比，△P＜0.05

組別對照組LPS組MSC組MSC-oli組n 3 3 3 3 iNOS 0.13±0.03 0.45±0.08*0.20±0.05#0.43±0.04*△eNOS 0.67±0.14 0.10±0.08*0.53±0.07#0.17±0.04*△VE-cadherin 0.42±0.13 0.15±0.04*0.26±0.09 0.24±0.07通透性指數(shù)1 2.74±0.45*1.34±0.23#2.34±0.56*△凋亡率（%）2.33±1.23 23.67±1.45*11.89±2.38*#20.45±2.89*△JC-1 0.11±0.03 0.24±0.02*0.15±0.03#0.23±0.03*△

圖3PMVECs細胞凋亡圖Figure 3 apoptosis of PMVECs

3 討 論

ARDS是臨床上常見的疾病，其主要以頑固性的低氧血癥和肺水腫為主要臨床表現(xiàn)，目前治療措施主要以肺保護性通氣、限制液體、俯臥位通氣、ECMO等手段為主［1］，但病死率仍很高。內(nèi)皮細胞是血管內(nèi)表面的單層結構（細胞表面積約1350μm2），當炎癥、腫瘤、動脈粥樣硬化等發(fā)生時，內(nèi)皮細胞的屏障功能會受到嚴重的影響，炎癥因子（如組胺、緩激肽、血小板活化因子等）會增加毛細血管的通透性，使血漿蛋白等進入肺泡，這也是ARDS最重要的發(fā)病機制［11］。我們使用MSC通常來源于骨髓、脂肪、胎盤等組織，是組織工程和再生醫(yī)學中最常用的細胞，很多文獻都分析了MSCs對ARDS等肺疾病的治療作用［12］，MSC主要是通過其表面的趨化因子、細胞黏附分子和細胞因子共同介導的歸巢作用［13］，分化為肺內(nèi)細胞［14］，調(diào)節(jié)炎癥反應，抑制免疫功能等進行肺保護［15］，主要機制包括細胞植入、傳導細胞信號以及轉(zhuǎn)移健康的細胞器［16］。線粒體作為細胞內(nèi)重要的細胞器，主要作用是通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量，在很多急、慢性疾病中都能發(fā)現(xiàn)了其功能發(fā)生障礙。Spees等［17］首次發(fā)現(xiàn)MSC可以向受損的A549細胞轉(zhuǎn)移mtDNA。在最新的研究中，Newell等［18］發(fā)現(xiàn)MSCs可以對宿主組織中線粒體的形態(tài)和功能產(chǎn)生特異性的影響，他們將MSC與患有線粒體疾病患者的成纖維細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)線粒體從分裂狀態(tài)變?yōu)槿诤蠣顟B(tài)，說明MSC具有調(diào)節(jié)病理性線粒體的能力。在一個急性肺損傷的模型中，MSC可以向上皮細胞中轉(zhuǎn)移線粒體，同時促進ATP和肺泡表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生［19］。Sinclair等［8］證實從骨髓、實質(zhì)肺組織及肺泡灌洗液中分離的MSCs可以向支氣管上皮細胞轉(zhuǎn)移線粒體。

目前尚無實驗研究MSC通過轉(zhuǎn)移線粒體對肺微血管內(nèi)皮細胞的直接修復作用。在本研究中，我們通過LPS對PMVEC預處理構建內(nèi)皮細胞損傷模型，LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，可通過sCD14和TLR4受體介導產(chǎn)生局部和全身炎癥反應［20-21］。然后通過向培養(yǎng)基中加入ATP酶抑制劑寡霉素，使其對呼吸鏈產(chǎn)生影響來抑制線粒體的功能［10］，結果顯示 MSC、MSC-oli與受損 PMVECs共培養(yǎng)后，MSC-oli組仍可以向PMVECs傳遞線粒體，但不能顯著增加內(nèi)皮細胞中線粒體相關蛋白的表達，這說明MSC可能通過微泡或者納米管等途徑傳遞失活的線粒體［22］。進一步我們通過共培養(yǎng)體系研究MSC的線粒體對間充質(zhì)干細胞修復肺微血管內(nèi)皮細胞的影響，結果顯示，MSC組可顯著提高受損內(nèi)皮細胞合成蛋白的表達，降低細胞通透性，減輕細胞凋亡，而MSC-oli組的結果恰恰相反。此外，MSC及MSC-oli組中，內(nèi)皮細胞的連接蛋白的表達無統(tǒng)計學差異。

綜上所述，本研究初步探討和研究的得出了MSCs可以向受損PMVECs傳遞線粒體，且能夠修復受損的內(nèi)皮細胞，但目前仍存在很多的不足，后續(xù)需要更多的基礎和臨床試驗來進一步驗證能量工廠線粒體對受損器官和組織的修復作用。