劉君逍，劉程曦，呂 萍，付 豹

0 引 言

丙泊酚因其起效迅速，患者麻醉蘇醒時間短，不良反應小，已經成為臨床上不可或缺的麻醉藥物，但是其具體的神經作用機制現(xiàn)在仍是未解之謎。腦電圖研究提示：全身麻醉藥物導致意識消失和恢復與大腦自然睡眠和覺醒的腦電變化有類似之處，而全身麻醉時意識改變的過程可能是大腦在睡眠與清醒之間的迅速轉換［1］。功能核磁共振研究也發(fā)現(xiàn)，在丙泊酚麻醉和睡眠狀態(tài)下，下丘腦和丘腦區(qū)均抑制輸出增強，且腦電圖也都以慢波節(jié)律為主，這些類似的變化說明全身麻醉和睡眠可能通過共同的神經環(huán)路發(fā)揮作用［1-5］。因此現(xiàn)代全身麻醉研究認為睡眠-覺醒相關通路可能是研究全身麻醉藥物作用機制的一個重要方向［6］。

室旁核位于背側中線丘腦，接受來自于基地前腦、中腦和間腦的廣泛投射［7］。室旁核參與調控多種生理功能如：睡眠-覺醒調控、獎賞行為、覓食行為、能量平衡以及情緒相關行為等［8-10］。近年來大量的研究均提示室旁核與調控麻醉覺醒的核團有密切的解剖和功能聯(lián)系，如接收來自藍斑的去甲腎上腺素能，中腦導水管灰質的多巴胺能，中縫背核的五羥色胺能，臂旁核的谷氨酸能投射，外側下丘腦的Orexin投射［11-13］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)中央內側丘腦的腎上腺素能傳輸系統(tǒng)參與調解丙泊酚麻醉蘇醒同時引起皮層腦電圖覺醒，而不引起麻醉誘導過程改變［14］，提示室旁核參與睡眠-覺醒過程，那么在丙泊酚麻醉-覺醒過程中室旁核的腎上腺素能受體起著怎么作用呢？故本實驗擬激動/抑制室旁核的腎上腺素α受體觀察其對丙泊酚麻醉蘇醒過程的影響，探索室旁核在全身麻醉中發(fā)揮的作用，以期為全身麻醉作用機制的研究提供一點理論依據，從而最大化的降低麻醉對患者的不良影響，如蘇醒延遲、術后認知功能障礙等［15］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物70只健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)于貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室SPF級動物房。飼養(yǎng)環(huán)境：不限制大鼠活動、飲水、飲食，動物房采用自動控制的12 h光/12 h暗周期，室內溫度23～26℃，相對濕度為60%左右。

1.2 實驗藥物1%丙泊酚（Fresenius Kabi，國藥準字 J20160089）、去 甲 腎 上 腺 素（Alfa Aesar，LO8O87）、酚妥拉明（Sigma，P7547-100MG）、普萘洛爾（Sigma，P0884-1G）、戊巴比妥（Merck，P11011）、水合氯醛（Aladdin，C104202）、一抗：Anti-c-fos親和純化兔抗體（synaptic system ，226003）、二抗：羊抗兔IgG（Life Technologies，A11008）。

1.3 微注射模型10%戊巴比妥麻醉后（45 mg/kg，腹腔注射），固定于腦立體定位儀，切開頭皮充分暴露顱骨，調節(jié)Bregma點和Lambda點，使其在同一水平位置。根據大鼠腦立體定位圖譜（Watson and Paxinos）定位室旁核坐標（前后：-2.7 mm，左右：0 mm，深度：5.4 mm）和右側前額葉mPFC坐標（前后+3.7 mm，右2 mm，深度1.5 mm），行顱骨鉆孔術暴露硬腦膜并輕輕撥開，置入微注射套管針、腦電記錄電極和參比電極。采用牙科水泥將套管針和電極固定在顱骨表面。術后3 d腹腔注射青霉素20 U降低感染率，獨籠飼養(yǎng)于本實驗室SPF級動物房。待術后恢復7 d，觀察無行為學異常后進行下一步實驗。

1.4 光纖鈣信號記錄模型隨機數(shù)字表法選取12只大鼠，按上述的方法麻醉固定老鼠，暴露顱骨并調平。在室旁核處注射病毒。以0.15μL/min的速度吸取病毒（rAAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA），以0.05μL/min的速度注射0.35μL病毒到目的位點，注射針原位停留10 min。完成注射后將光纖陶瓷插芯放置在注射位點上方200μm處并固定。完成后單籠飼養(yǎng)4周，待病毒轉染。

1.5 免疫熒光實驗8只雄性SD大鼠隨機數(shù)字表法分為兩組：丙泊酚組和對照組（n=4）。丙泊酚組與對照組均在1.5%異氟醚吸入麻醉下行大鼠尾靜脈穿刺置管，置管成功后置于誘導箱內，待大鼠蘇醒并自由活動0.5 h。丙泊酚組推注丙泊酚快速誘導使大鼠的意識消失（11 mg/kg，靜脈注射），連接微注射泵連續(xù)泵注丙泊酚［48 mg/（kg·h）］，麻醉維持2 h后灌注取腦。2 h后對照組10%水合氯醛麻醉后（4 mg/kg，腹腔注射），立刻在劍突下取適當?shù)那锌?，充分暴露大鼠心臟，4%的多聚甲醛灌流固定腦組織，灌流結束后斷頭咬除顱骨，取出腦組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再將其浸泡在30%葡萄糖溶液中。腦組織沉底后，根據解剖標志確定室旁核的位置，利用振蕩切片機進行冠狀位組織切片，厚度為30μm。封閉液封閉2 h-一抗孵育48 h-搖床脫色洗片-熒光二抗孵育2 h-搖床脫色洗片-熒光顯微鏡觀察，比較在室旁核區(qū)丙泊酚組和對照組的cfos陽性表達量的強度。

1.6 光纖鈣信號記錄實驗在避光條件下，測量原始的光強待基線穩(wěn)定。大鼠在透明誘導箱內適應10 min后，連接跳線與大鼠頭部的陶瓷插芯，記錄大鼠的光纖信號。清醒狀態(tài)下記錄10 min，然后以11 mg/kg的劑量尾靜脈單次注射丙泊酚，標記大鼠翻正反射消失（loss of right reflex，LORR）和翻正反射恢復（recovery of right reflex，RORR），待大鼠翻正反射恢復后繼續(xù)記錄10 min。LORR定義為將大鼠置于仰臥位，30 s內不能從仰臥位變?yōu)楦┡P位。RORR定義為大鼠在仰臥位時，5 s內能夠恢復正常體位，即四腳同時著地。

1.7 室旁核微注射實驗將室旁核腦區(qū)微注射模型大鼠隨機數(shù)字表法分為4組：去甲腎上腺素組、酚妥拉明組、普萘洛爾組和等滲鹽水組（n=10）。

1.7.1 行為學記錄尾靜脈置管后將大鼠放入誘導箱內適應30 min，然后取下微注射導管帽，拔出導管芯并連接好微注射內管。4組大鼠分別給予1μL去甲腎上腺素、酚妥拉明、普萘洛爾和等滲鹽水后，取出微注射管芯。尾靜脈連接延長管連續(xù)泵注丙泊酚［48 mg/（kg·h）］，翻正反射消失后繼續(xù)維持麻醉20 min，然后停止泵注丙泊酚，觀察并記錄大鼠翻正反射恢復時間RORR時間。RORR時間以停止麻醉維持時間為起點，大鼠翻正反射恢復的時間為終點計算而得。

1.7.2 腦電記錄尾靜脈置管后將大鼠放入誘導箱內適應30 min，然后經尾靜脈推注丙泊酚快速誘導（11 mg/kg），使大鼠意識消失，連接好微注射內管。尾靜脈連接延長管連續(xù)泵注丙泊酚麻醉維持30 min［48 mg/（kg·h）］，并且連續(xù)記錄mPFC腦電活動，觀察室旁核微注射對大鼠mPFC腦電活動［δ波（1～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α波（8～12 Hz）、β波（12～25 Hz）、γ波（25～60 Hz）］的影響。在麻醉維持的第20 min開始室旁核腦區(qū)微注射，4組大鼠分別給予1μL去甲腎上腺素、酚妥拉明、普萘洛爾和等滲鹽水。麻醉維持30 min停止泵注丙泊酚和腦電記錄，取出微注射管芯和延長管。

1.8 免疫熒光及免疫組化驗證腦區(qū)微注射實驗結束后均要進行組織學驗證，確定導管插入位置。10%戊巴比妥鈉麻醉后（45 mg/kg，腹腔注射），灌注固定腦組織并脫水切片，行HE染色后，將切片置于顯微鏡下觀察。對照大鼠腦立體定位圖譜，將微注射導管植入位置準確的數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，位置不正確的數(shù)據舍棄。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，否則以中位數(shù)（上四分位數(shù)～下四分位數(shù)）［M（P25～P75）］表示。在符合正態(tài)分布和方差齊的條件下，比較行為學實驗結果RORR時間采用獨立樣本t檢驗進行分析，微注射前后腦電功率譜中的腦電圖變化以及LORR和RORR事件前后鈣信號的差異通過配對t檢驗分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 免疫熒光與對照組相比，丙泊酚組的c-fos表達量明顯下降，這一結果表明大鼠室旁核神經元的活性在丙泊酚麻醉時降低。見圖1。

圖1 鏡下觀察c-fos形態(tài)（免疫熒光染色×100）Figure 1 Expression of c-fos in the PVT neurons of the rats in the control and propofol anesthesia groups（IHS ×100）

2.2 光纖鈣信號記錄在丙泊酚誘導LORR時，相比于清醒基線，誘導期Ca2+信號增加；但麻醉早期和麻醉期Ca2+信號均顯著減少（P＜0.05）。在出現(xiàn)RORR期間，觀察到室旁核Ca2+信號的驟然增加；與麻醉基線相比，蘇醒早期和蘇醒期Ca2+信號顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 尾靜脈單次注射丙泊酚發(fā)生LORR和RORR光線鈣信號記錄結果Figure 2 PVT neural dynamics in response to propofol anesthesia

2.3 室旁核微注射與等滲鹽水組相比，去甲腎上腺素組的蘇醒時間縮短（837.8 svs647.7s，P＜0.05），且微注射后腦電圖的δ波頻率降低（P＜0.05），β波頻率增高（P＜0.05）；與等滲鹽水組相比，酚妥拉明組丙泊酚麻醉的蘇醒時間（1045.1 s）延長（P＜0.05），且微注射后腦電圖的δ波頻率增高（P＜0.05）；與等滲鹽水組相比，普萘洛爾組蘇醒時間（834.2 s）無變化，微注射后腦電圖沒有改變（P＞0.05）。見表1。

表1 丙泊酚麻醉下室旁核微注射前后的腦電結果（n=10）Table 1 EEG changes under PVT microinjecting in propofol anesthesia（n=10）

3 討 論

室旁核是丘腦中線核團之一，位于丘腦背內側前后軸，具有密集的谷氨酸能神經元，組成丘腦非特異投射系統(tǒng)。室旁核是覺醒中樞的關鍵丘腦節(jié)點，抑制室旁核神經元的活性可以導致清醒時間的減少，而室旁核神經元的激活加速睡眠到覺醒的轉換和縮短異氟醚麻醉蘇醒時間［16］。早期研究表明［8］，睡眠時期室旁核區(qū)域的c-fos表達量明顯低于清醒時期。Ren等［16］研究也發(fā)現(xiàn)室旁核神經元的c-fos表達量呈現(xiàn)晝夜節(jié)律相關，而且相較于中線丘腦的其他核團，無論清醒或睡眠時，室旁核都有較高水平的c-fos表達；但是清醒狀態(tài)下室旁核神經元細胞的Ca2+活性和c-fos表達量均明顯高于睡眠狀態(tài)。我們實驗也發(fā)現(xiàn)丙泊酚麻醉期間室旁核區(qū)域cfos表達量明顯低于蘇醒后，而且丙泊酚麻醉翻正反射消失時室旁核神經元Ca2+活性下降，在丙泊酚麻醉期間神經元活動處于較為穩(wěn)定的低水平狀態(tài)；在翻正反射恢復時室旁核神經元Ca2+活性驟升。光纖鈣信號的實時記錄能較為客觀的反應神經元的活性，同時c-fos也是反應神經元活性的經典指標。本實驗通過記錄室旁核麻醉和清醒狀態(tài)下的c-fos和Ca2+活性提示：丙泊酚可能通過抑制室旁核神經元的活動誘導麻醉，故為了進一步研究室旁核在丙泊酚麻醉中作用，采用微注射和腦電結合的方式探討其具體作用機制。

基于本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)特異性毀損斑馬魚藍斑核（locus coeruleus，LC）的去甲腎上腺素能神經元或DBH基因敲除的斑馬魚（NE合成酶）均能加速丙泊酚麻醉誘導，延長蘇醒，提示LC-NE系統(tǒng)是腦內重要的促覺醒通路，也是全身麻醉藥物作用的重要靶點［17］。Hu等［18］也發(fā)現(xiàn) DBH基因敲除的小鼠（NE合成酶）對吸入麻醉藥敏感性增強，主要表現(xiàn)為小鼠的誘導時間變短，恢復時間變長。Vazey等［19］采用化學遺傳學技術選擇性地激活大鼠的LC-NE神經元，使異氟醚麻醉誘導時間顯著延長，而異氟醚麻醉的蘇醒時間明縮短。以上研究均表明LC-NE系統(tǒng)調控全身麻醉蘇醒過程，但LC-NE上行作用靶點和具體機制至今仍不明確。另有研究發(fā)現(xiàn)在丙泊酚麻醉中以推挽灌流技術洗脫新西蘭兔室旁核的NE發(fā)現(xiàn)室旁核的NE釋放顯著降低，但依托咪酯則不會影響室旁核的NE釋放?；诖罅垦芯孔C明LC有大量投射到室旁核［8，12-13］，故我們選取室旁核微注射去甲腎上腺素，及α受體拮抗劑酚妥拉明，β受體拮抗劑普萘洛爾，觀察研究室旁核腎上腺素能神經元在丙泊酚麻醉蘇醒過程中作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，室旁核微注射NE可以加速丙泊酚麻醉的蘇醒，且伴隨δ波減少，而β波增多；微注射酚妥拉明可以明顯延長丙泊酚麻醉的蘇醒時間和增加δ波、θ波比率，但普萘洛爾則不影響丙泊酚麻醉蘇醒時間和腦電。腦電圖能較為客觀的反應皮層神經元的興奮性，一般認為睡眠期間是以高幅低頻＜8 Hz的（δ波、θ波）為主；在清醒期間則是以低幅高頻的β波為主。最近有報道采用光遺傳學技術，特異性激活室旁核神經元可以產生從快速動眼睡眠到清醒的轉變，以及清醒狀態(tài)下腦電圖δ波的減少；而毀損室旁核神經元可以增加清醒狀態(tài)時腦電圖的δ波［16］。早有研究報道靜脈注射α 2受體激動劑可樂定延長丙泊酚麻醉誘導時間伴隨著皮層NE釋放減少，而拮抗劑育亨賓則會產生相反的效果。而特異性激活LC-NE神經元不僅加速異氟醚麻醉大鼠的蘇醒，且伴隨皮層的δ波比率下降，θ波比率升高［20］。Pillay和其同事研究發(fā)現(xiàn)基底前腦Meynert基底核微注射NE促進地氟醚麻醉的覺醒，降低前額葉皮層δ波比率，表明基底核NE通路可能通過上行激活皮層調解麻醉深度［21］。近期研究發(fā)現(xiàn)CMT微注射NE加速丙泊酚麻醉蘇醒并引起前額葉皮層δ波減少，并且采用膜片鉗技術發(fā)現(xiàn)NE可以減弱丙泊酚引起的CMT內抑制性GABA的釋放，削弱丙泊酚的對CMT抑制效應［14］。Du等［17］也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以引起斑馬魚LC神經元超極化。我們的研究也提示室旁核參與調控丙泊酚的蘇醒過程，并且可能通過作用于室旁核的腎上腺素能α受體參與丙泊酚麻醉覺醒和引起皮層的覺醒。

基于我們的實驗，我們推測室旁核是丙泊酚作用的靶點之一，而室旁核的腎上腺素能輸入可能是通過激活α受體發(fā)揮其促覺醒效能。