賀繼剛，謝巧麗，王梓豪，嚴(yán) 丹，李 文

0 引 言

既往有研究實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（cardiomyocyte transcription factor，GATA-4）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分泌的外泌體（BMSCGATA-4-exosome）可以抑制心肌細(xì)胞凋亡并改善心肌梗死后心功能，并發(fā)現(xiàn)在BMSCGATA-4-exosome中miR-330-3p明顯高表達(dá)，其可能是修復(fù)心肌損傷的關(guān)鍵分子［1］?；诖?，本實(shí)驗(yàn)利用在BMSCGATA-4體系內(nèi)過表達(dá)miR-330-3p并提取分泌的外泌體與心肌細(xì)胞在低氧無血清下共培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞檢測其凋亡率。RT-PCR檢測心肌細(xì)胞內(nèi)miR-330-3p的表達(dá)量。根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫推測miR-330-3p對(duì)應(yīng)靶基因，采用Western blot檢測靶基因轉(zhuǎn)錄蛋白的表達(dá)，對(duì)其抗凋亡的分子機(jī)制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)試圖對(duì)BMSCGA-TA-4-exosome抑制心肌細(xì)胞凋亡分子調(diào)控機(jī)制解析，為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料小鼠心肌細(xì)胞購自上海賽齊，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國gibco公司），miR-330-3p mimic試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司），外泌體提取試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司），Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit（廣州市銳博生物科技有限公司），Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer（廣州市銳博生物科技有限公司），cel-miR-39引物、miR-330-3p引物（廣州市銳博生物科技有限公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司AD10），Ap2m1一抗（上海玉博生物科技有限公司），Cnot4一抗（上海玉博生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠BMSC的分離和培養(yǎng)及鑒定全骨髓培養(yǎng)小鼠BMSC，胰蛋白酶消化傳至第3代時(shí)采用CD11b的磁珠負(fù)選，去除造血干祖細(xì)胞。繼續(xù)傳至P7代。取增殖至P7代BMSC，待細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)。制備單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞檢測CD29、CD11b、CD44、SCA-1（PE-CD29單抗5 μL作1∶20稀釋至100μL、PE-CD11b單抗5μL作1∶40稀釋至100μL、PE/Cy5-CD44 5μL作1∶20稀釋至100μL、FITC anti-mouse SCA-1 5μL作 1∶20稀釋至 100μL），具體見參考文獻(xiàn)［1］。

1.2.2 慢病毒載體及基因開啟技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)GATA-4 BMSCs將已構(gòu)建成功的GATA-4基因插入慢病毒包裝質(zhì)粒GV308中，構(gòu)建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DOX），轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染了GATA-4基因細(xì)胞（97.269）的GATA-4基因表達(dá)豐度為未轉(zhuǎn)染GATA-4基因細(xì)胞（1.000）的97.27倍，具體見文獻(xiàn)［1］。

1.2.3 細(xì)胞的分組及處理正常條件下單獨(dú)培養(yǎng)24 h的心肌細(xì)胞（×105個(gè)）作為陰性對(duì)照組，低氧無血清條件下單獨(dú)培養(yǎng)24 h的心肌細(xì)胞（×105個(gè)）作為陽性對(duì)照組，另將BMSC分泌的exosome（5μg/mL）與心肌細(xì)胞（×105個(gè)）共培養(yǎng)作為BMSC組、BMSCGA-TA-4-空載體-exosome（5 μg/mL）與心肌細(xì)胞（×105個(gè)）共培養(yǎng)作為空載體組、BMSCGATA-4-exosome（5 μg/mL）與心肌細(xì)胞（×105個(gè)）共培養(yǎng)作為過表達(dá)GATA-4組、BMSCGATA-4-miR-330-3p-mimic-exosome（5 μg/mL）與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)（×105個(gè)）作為過表達(dá)miR-330-3p組在低氧無血清條件下培養(yǎng)24 h的細(xì)胞（三氣培養(yǎng)箱1%O2、5%CO2，平衡氣體為N2培養(yǎng)）。

1.2.4 采用RT-PCR方法檢測提取總RNA，按照Bulge-Loop miRNA qRT-PCR StarterKit和Bulge-Loop miRNAqRT-PCRPrimer試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。隨后完成目的基因擴(kuò)增（95℃：10 min；95℃：2 s；60℃：20s；70℃：10s）。收集信息，做Ct值分析。

1.2.5 根據(jù)基因庫推測miR-330-3p的靶基因采用 miRWalk、Microt4、miRanda、mirbridge、miRDB、miRMap、miRNAMap、Pictar2、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan數(shù)據(jù)庫對(duì)mmu-miR-330-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測（篩選條件：靶基因總和＞10同時(shí)靶基因與miRNA的匹和度＞8），可見mmu-miR-330-3p對(duì)應(yīng)的靶基因?yàn)椋篈p2m1、Cnot4。

1.2.6 用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和Western blot技術(shù)檢測Ap2m1、Cnot4的表達(dá)準(zhǔn)備上述各組經(jīng)預(yù)處理的心肌細(xì)胞用于低氧（1%）無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常條件下培養(yǎng)心肌細(xì)胞作為陰性對(duì)照組培養(yǎng)24 h。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率。用Western blot檢測各組心肌細(xì)胞中Ap2m1、Cnot4的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各細(xì)胞亞群間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠BMSCs CD29、CD44及SCA-1的表達(dá)超過90%小鼠的BMSC表達(dá)CD29（表達(dá)率為99.71%）、CD44（表達(dá)率為97.28%）和SCA-1（表達(dá)率為99.4%），但僅0.1%的細(xì)胞表達(dá)CD11b。見圖1。

圖1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定結(jié)果Figure 1 Flow cytometric identification of the mouse bone marrow mesenchymal stem cells

2.2 各組細(xì)胞的凋亡率及心肌細(xì)胞內(nèi)miR-330-3p的表達(dá)比較過表達(dá)miR-330-3p組心肌細(xì)胞早期凋亡率較陰性對(duì)照組高，但較陽性對(duì)照組、BMSC組、空載體組、過表達(dá)GATA-4組明顯降低（P＜0.05）。過表達(dá)miR-330-3p組心肌細(xì)胞內(nèi)的miR-330-3p的表達(dá)較陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、BMSC組、空載體組、過表達(dá)GATA-4組明顯增高（P＜0.05）。見表1，圖2。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡率及心肌細(xì)胞內(nèi)miR-330-3p表達(dá)量比較(± s,n=6)Table 1 Apoptosis of cardiomyocytes and the expression of miR-330-3p in the cardiomyocytes in different groups(±s,n=6)

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡率及心肌細(xì)胞內(nèi)miR-330-3p表達(dá)量比較(± s,n=6)Table 1 Apoptosis of cardiomyocytes and the expression of miR-330-3p in the cardiomyocytes in different groups(±s,n=6)

與過表達(dá)miR-330-3p組比較，*P＜0.05

組別陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組BMSC組空載體組過表達(dá)GATA-4組過表達(dá)miR-330-3p組凋亡率(%)2.30±0.09*51.48±0.40*18.32±3.03*16.99±2.93*10.22±0.35*7.90±0.34 miR-330-3p 1.37±0.33*0.26±0.32*1.40±0.42*1.41±0.27*3.80±0.62*396.10±1.02

2.3 各組心肌細(xì)胞中Ap2m1和Cnot4的表達(dá)水平過表達(dá)miR-330-3p組心肌細(xì)胞內(nèi)Ap2m1的表達(dá)較陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、BMSC組、空載體組、過表達(dá)GATA-4組明顯下降（P＜0.05）。見圖3。

圖2 各組凋亡率流式細(xì)胞圖片F(xiàn)igure 2 Flow cytometry images for the apoptosis of cardiomyocytes in different groups

圖3 各組心肌細(xì)胞中Ap2m1和Cont4的表達(dá)水平Figure 3 Expressions of Ap2m1 and Cont4 in the cardiomyocytes in different groups

3 討 論

前期我們已經(jīng)證明過表達(dá)GATA-4的BMSCs分泌的外泌體可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡有效的修復(fù)心肌梗死引起的心肌損傷［1］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在其分泌的外泌體中miRNA-330-3p其明顯高表達(dá)且功能涉及抗凋亡，提示我們miRNA-330-3p可能是exosome修復(fù)心肌損傷的關(guān)鍵分子。由于外泌體為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)小體，內(nèi)含miRNA、蛋白質(zhì)。其可以遠(yuǎn)距離作用于受體細(xì)胞，并將所攜帶物質(zhì)釋放入細(xì)胞內(nèi)，從而影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能［1-2］。因而認(rèn)為miR-330-3p被外泌體攜帶，釋放入心肌細(xì)胞，而影響心肌細(xì)胞的抗凋亡功能。BMSCs已經(jīng)證實(shí)可以在多種疾病中起修復(fù)作用［3-4］。

miR-330-3p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA。其在不同類型的癌癥中的表達(dá)具有爭議。有研究表明，即使是相同的miRNA針對(duì)同一基因，但在不同的組織中也可能表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)［5-7］。miR-330-3p在乳腺癌、肝癌、食道癌、肺癌和膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)［8-10］。然而，一些研究又表明miR-330-3p在胃癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中表達(dá)下調(diào)［11-13］。不同的表達(dá)狀態(tài)提示miR-330-3p可能在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用。在乳腺癌等病變中，其具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長，逃逸。在胃癌等病變中，其可以抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)其凋亡［14-15］。本實(shí)驗(yàn)中通過流式細(xì)胞檢測凋亡證實(shí)過表達(dá)miR-330-3p組心肌細(xì)胞凋亡率最低，同時(shí)證實(shí)其心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-330-3p表達(dá)最高，說明miRNA-330-3p具有抗細(xì)胞凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究了miRNA-330-3p抗凋亡分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。根據(jù) miRWalk、Microt4、miRanda、mirbridge、miRDB、miRMap、miRNAMap、Pictar2、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-330-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測（篩選條件：靶基因總和＞10同時(shí)靶基因與miRNA的匹和度＞8），可見miR-330-3p對(duì)應(yīng)的靶基因?yàn)椋篈p2m1、Cnot4。本實(shí)驗(yàn)采用western blot檢測了各組共培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞內(nèi)Ap2m1、Cnot4蛋白的表達(dá)。miR-330-3p表達(dá)量升高，則其對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)量降低。可見Ap2m1蛋白呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，即其表達(dá)量的關(guān)系為：陰性對(duì)照組＜過表達(dá)miR-330-3p組＜過表達(dá)GATA-4組＜空載體組=BMSC組＜陽性細(xì)胞組。而Cnot4蛋白變化無規(guī)律性，即其表達(dá)量的關(guān)系應(yīng)該為：陰性對(duì)照組＜過表達(dá)miR-330-3p組＜過表達(dá)GATA-4組＜空載體組=BMSC組＜陽性細(xì)胞組，但Cnot4蛋白表達(dá)量的關(guān)系實(shí)際為：陽性對(duì)照組＜陰性對(duì)照組=空載體組＜BMSC組＜過表達(dá)GATA-4組＜過表達(dá)miR-330-3p組。因此可以推測miR-330-3p主要通過Ap2m1途徑起抗凋亡作用，。

Ap2m1蛋白在丙型肝炎感染肝細(xì)胞時(shí)具有重要作用。據(jù)Neveu等［16］報(bào)道，丙型肝炎核心蛋白酪氨酸的修飾與AP2m1相互作用是病毒組裝感染肝細(xì)胞時(shí)所必需的分子及靶點(diǎn)。此外據(jù)Le Duff M等［17］報(bào)道，他們檢測了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)過程中AP2m1的表達(dá)，首次使用HCT116 p21-/-細(xì)胞（該細(xì)胞對(duì)死亡更敏感）檢測SN38處理后的亞G1細(xì)胞，證實(shí)了細(xì)胞凋亡。該結(jié)果表明，在沒有細(xì)胞周期抑制劑的情況下，AP2m1的上調(diào)是有限的，這與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但Mikula等［18］報(bào)道：對(duì)內(nèi)質(zhì)小體內(nèi)化過程進(jìn)行干擾，通過AP2m1蛋白的缺失，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)小體內(nèi)的EGFR數(shù)量減少，并抑制Pol2、EGFR/ERK途徑對(duì)Egr1基因的募集。在抗凋亡過程中，EGFR/ERK途徑一般是激活的，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相反的，說明Ap2m1蛋白的功能還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，過表達(dá)GATA-4的BMSCs分泌的外泌體通過miR-330-3p抑制Ap2m1蛋白表達(dá)抗心肌細(xì)胞凋亡。