盛鳳仙，李 萍

(上海新興醫(yī)藥股份有限公司,上海 200135)

目前，上海新興醫(yī)藥股份有限公司采用國際先進的低溫乙醇壓濾法(Cohn法)[1-2]制備人血白蛋白等血液制品,該工藝生產(chǎn)過程中要求嚴格控制五大關鍵參數(shù)，分別是溫度、pH、離子強度、蛋白濃度和乙醇濃度，對前4個參數(shù)都已建立了檢測方法，并且進行了測定，而乙醇濃度采用稱重法計算而得,該法誤差相對較大，會影響到產(chǎn)品的純度和得率。為了更好地控制產(chǎn)品質量，確保生產(chǎn)出持續(xù)穩(wěn)定的符合藥品質量標準和注冊要求的產(chǎn)品，配合工藝驗證的需求，筆者參考有關文獻[3-5]，利用氣相色譜法對血液制品生產(chǎn)過程中中間品乙醇的含量測定方法進行了探討。

1 材料

1.1 儀器與試藥

安捷倫6890N氣相色譜儀；無水乙醇(AR級，國藥集團化學試劑有限公司，含量≥99.7%)；正丙醇(AR級，國藥集團化學試劑有限公司，含量≥99.0%)；鎢酸鈉(AR)；硫酸(AR)；10%鎢酸鈉溶液(取鎢酸鈉10 g，加注射用水定容至100 ml)；0.33 mol/L硫酸溶液(取硫酸1.86 ml 緩緩注入適量注射用水中，放冷，定容至100 ml)，樣品由研究部提供(8%乙醇蛋白溶液，批號：ALB 20170119；20%乙醇蛋白溶液，批號：ALB 20170119；40%乙醇蛋白溶液，批號：ALB 20170119)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

精密吸取平衡至室溫的1.0 ml樣品溶液置于10 ml容量瓶中，精密加入0.2 ml正丙醇內(nèi)標溶液，再加入1 ml 10%鎢酸鈉溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度，混勻，靜置30 min后，用0.45 μm水溶性膜過濾，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細管色譜柱(0.25 mm ×30 m,1.4 μm)；FID檢測器；氣化室溫度230℃；檢測器溫度280℃；柱溫：40℃保持5 min后，以10℃/min升溫至80℃，再以50℃/min升溫至230℃，保持3 min；柱流量：1 ml/min；空氣：400 ml/min；氫氣：40 ml/min；分流比100∶1；進樣量0.5 μl。

2.3 專屬性試驗

精密吸取不含乙醇的含蛋白0.1%的空白溶液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，不加正丙醇內(nèi)標，加入1 ml 10%鎢酸鈉溶液和1 ml 0.33 mol/L硫酸溶液，用注射用水定容至刻度,混勻,靜置30 min后用0.45 μm水溶性膜過濾，取0.5 μl按 “2.2” 項下色譜條件測定，記錄色譜圖(圖1)；另外，分別取按“2.5”項下方法制備的對照品溶液和按“2.1”項下方法制備的供試品溶液0.5 μl，同樣按 “2.2” 項下色譜條件測定，記錄色譜圖(圖2、圖3)。從圖1可見，沒有色譜峰出現(xiàn)，說明處方中其他成分對乙醇含量測定無干擾；從圖3可見，乙醇峰與正丙醇峰完全分離，分離度大于1.5，互不干擾，專屬性好。

圖1 空白溶液色譜圖

圖2 對照品溶液色譜圖1.乙醇；2.正丙醇內(nèi)標

圖3 供試品溶液色譜圖1.乙醇；2.正丙醇內(nèi)標

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

從圖2可知，乙醇峰與正丙醇內(nèi)標峰保留時間分別約為4.4 min和7.5 min；乙醇峰與正丙醇內(nèi)標峰分離度為41.07，乙醇峰理論塔板數(shù)為54 888，均符合《中國藥典》要求。

2.5 線性關系考察

精密量取無水乙醇對照品0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 ml，分別置于已預先加入適量注射用水的10 ml容量瓶中，再向各對照品容量瓶中精密加入0.20 ml正丙醇內(nèi)標溶液,用注射用水定容至刻度，混勻，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以各乙醇對照品峰面積與正丙醇峰面積之比(X)，對乙醇對照品溶液濃度(Y，%)繪制曲線，得線性回歸方程為Y=2.728 5×10-3X+ 2.569 8，r=1.000 0。結果表明，乙醇對照品濃度在0.5%～5%范圍內(nèi)，乙醇對照品峰面積與正丙醇峰面積之比呈良好的線性關系。

2.6 回收率試驗

精密量取3.20、4.00、4.80 ml無水乙醇對照品，分別置于已預先加入適量不含乙醇0.1%蛋白溶液的10 ml量瓶中，用不含乙醇0.1%蛋白溶液定容至刻度，混勻后即得32.0%乙醇蛋白溶液、40.0%乙醇蛋白溶液、48.0%乙醇蛋白溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按 “2.2” 項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率，結果詳見表1。

表1 乙醇回收率試驗結果(%，n=9)

2.7 精密度試驗

取按“2.5”項下方法制備的對照品溶液，并按 “2.2” 項下色譜條件操作，連續(xù)測定5次，記錄峰面積，結果乙醇對照品峰面積與正丙醇內(nèi)標峰面積之比(X)的RSD為0.16 %，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取8%乙醇蛋白溶液(批號：ALB20170119)，按

“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8和12 h按 “2.2” 項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果表明乙醇對照品峰面積與正丙醇內(nèi)標峰面積之比分別為0.317 1、0.317 3、0.317 6、0.317 3，RSD為0.06%，表明處理后樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗

取同一批(批號：ALB20170206)40%乙醇蛋白溶液樣品6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按 “2.2” 項色譜條件檢測，記錄峰面積，結果樣品中乙醇含量分別為39.00%、39.31%、39.38%、39.43%、39.36%、39.46%，平均含量為39.32%，RSD為0.42%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.10 樣品含量測定

分別取同一批樣品(批號：ALB20170119)而含不同濃度(8%、20%、40%)乙醇的蛋白溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按 “2.2”項色譜條件測定，記錄峰面積，以線性回歸方程計算得到供試品中乙醇含量，結果均符合要求，詳見表2。

表2 樣品中乙醇含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

本實驗條件下，在空白溶液色譜圖中未見色譜峰出現(xiàn)，無其他雜質峰出現(xiàn)，專屬性好；在本實驗的典型圖譜中，乙醇與內(nèi)標正丙醇相鄰兩峰完全分開，分離度大于2，乙醇峰理論塔板數(shù)大于10 000，符合藥典要求。

3.2 實驗注意事項

實驗中應注意：必須用校正過的移液器，以確保加入內(nèi)標正丙醇的量準確，混合必須充分均勻，沉淀蛋白必須完全，這樣才能確保實驗順利進行和結果的準確性。

3.3 本法優(yōu)點

本法以正丙醇作為內(nèi)標，與其他方法(如比色法)[6-8]相比，具有操作簡單、方法靈敏、測定結果準確可靠、重復性好等優(yōu)點，可用于血液制品生產(chǎn)過程中對中間品乙醇含量的測定。