姚 婷，謝惠林，鄧勝國(guó),，趙雅倩，董加寶*

(1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；2.江華縣同泰中藥飲片有限公司，湖南 江華 425500)

月桂(Laurus nobilis L.)是樟科月桂屬亞熱帶樹種，原產(chǎn)于地中海沿岸，我國(guó)的江蘇、浙江、四川、山東、陜西、福建及云南等省有大量栽培。月桂葉中含有多糖類、多酚類化合物、氨基酸、粗蛋白、粗纖維、有機(jī)酸、維生素、礦質(zhì)元素、萜類和黃酮類化合物等。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中月桂葉中揮發(fā)油和黃酮類研究較多，其他成分的研究較少[1-3]。月桂葉水提物可作為止瀉劑，用于腸胃疾病的治療[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：永州本地月桂葉于2019年3月25日采自湖南科技學(xué)院逸夫樓前，洗凈、晾干、干燥、粉碎、過篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：無水乙醇、95%乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖均為分析純。

1.2 主要儀器

AY220型電子分析天平；722型紫外可見分光光度計(jì)；DF-101S型集熱式磁力攪拌器；CN61M/F120型植物粉碎機(jī)；WG-71電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵；ZLS-2離心機(jī)。

2 方法

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定及多糖含量測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定及多糖含量測(cè)定按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

月桂葉中多糖提取得率 = CNV/m

式中，C為樣品稀釋液的多糖濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為最初樣品定容體積(mL)；m為月桂葉的質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗(yàn)

精確稱取月桂葉粉約5.0 g 置于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL的無水乙醇回流1 h，過濾，得到濾渣。

向?yàn)V渣中加入一定量的蒸餾水，在一定溫度下回流一定時(shí)間，濾液于25 mL容量瓶中定容，取1 mL定容液在100 mL容量瓶中，再次定容，制得樣品稀釋液。研究提取溫度、提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)四個(gè)因素對(duì)月桂葉多糖提取得率的影響。

2.2.1 提取溫度的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水料比16∶1，水浸取時(shí)間1 h，研究提取溫度為50、60、70、80、90、99℃時(shí)對(duì)多糖提取得率的影響。

2.2.2 提取時(shí)間的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水浸取溫度為80℃，水料比16∶1，研究提取時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)對(duì)多糖提取得率的影響。

2.2.3 料液比的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水浸提溫度80℃，水浸提時(shí)間1 h，研究液料比為8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1 時(shí)對(duì)多糖提取得率的影響。

以上試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行組，求平均值。

2.3 提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度，提取時(shí)間，料液比3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按響應(yīng)面安排試驗(yàn)，以多糖得率作為提取效果的指標(biāo)，分析試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選最佳提取工藝，得到月桂葉多糖響應(yīng)面提取的最佳工藝[8-9]，試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 月桂葉多糖提取的單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取溫度對(duì)月桂葉多糖得率的影響

提取溫度對(duì)月桂葉多糖得率的影響如圖1所示。隨溫度的升高，多糖提取率不斷增加，到達(dá)80℃基本不再增加，趨于平緩，在90℃后多糖得率更有下降，可能是因?yàn)檩^高溫度破壞了部分浸出的多糖，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出也將增加，從而使多糖的提取量略有降低。隨著溫度的升高，多糖色澤加深，考慮到高溫可能對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)與活性有一定影響，溫度過高多糖易產(chǎn)生降解，而且溫度過高，水分容易揮發(fā)，給操作帶來不便，所以選擇80℃作為提取的最佳溫度。

圖1 提取溫度對(duì)月桂葉多糖得率的影響

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)月桂葉多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)月桂葉多糖得率的影響如圖2所示。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)可以促進(jìn)多糖的溶解，2 h后提取率基本保持不變。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，熱水可能致使月桂葉原料中大分子多糖分解，導(dǎo)致多糖提取量略有下降。此外，提取時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)使溶解的雜質(zhì)增多，使多糖的純度降低，同時(shí)加熱時(shí)間若過長(zhǎng)，能耗明顯要增加，從節(jié)約能源、減少生產(chǎn)周期考慮，故選擇2 h作為最佳提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)月桂葉多糖得率的影響

3.1.3 液料比對(duì)月桂葉多糖得率的影響

圖3 液料比對(duì)月桂葉多糖得率的影響

液料比對(duì)月桂葉多糖得率的影響如圖3所示。隨液料比的增大，多糖得率有提高的的趨勢(shì)，當(dāng)液料比等于16∶1時(shí)多糖得率最高，然而，當(dāng)液料比大于16∶1時(shí)，多糖得率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)溶劑量不足時(shí)，多糖提取不充分，導(dǎo)致多糖得率較低。當(dāng)溶劑劑量過多時(shí)，會(huì)使其他雜質(zhì)同時(shí)溶出，從而影響月桂葉多糖的溶出，使得實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性降低，從而影響多糖得率。因此，選取液料比為16∶1左右最佳。

3.2 月桂葉提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以月桂葉多糖提取得率為響應(yīng)值，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)3個(gè)因素為自變量，建立三因素三水平中心組合試驗(yàn)，共17個(gè)試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 提取率響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

3.3 回歸方程的建立

采用Design expert 8.0.6對(duì)表中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)?；貧w，得到月桂葉提取時(shí)間(B)、液料比(C)的二次多項(xiàng)模擬方程：

Y=1.47+0.47A-0.42B-1.17C+0.24AB-0.21AC+0.64BC-2.09A2-0.68B2-2.94C2

為了更好的驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)回歸方程的實(shí)用性，同時(shí)也為了更好的確定各因素對(duì)月桂葉多糖得率的影響程度，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表3。由方差分析可知:模型的F=118.54模型的顯著水平p小于0.0001，遠(yuǎn)小于0.01，表明實(shí)驗(yàn)所采用的二次多項(xiàng)模型是極顯著的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的[10]。該實(shí)驗(yàn)方法是可行的。用失擬項(xiàng)來表示所選用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，即二者的差異程度。本實(shí)驗(yàn)的失擬項(xiàng)的P值為0.0514>0.05，不顯著，對(duì)模型是有利的，沒有失擬因素存在，所以可以用方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。該模型的決定系數(shù)R2=0.9851。也說明該模型能夠較好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。各因素的效應(yīng)關(guān)系為PA、PB、PC、PA2、PB2、PC2、PBC均小于0.05，說明提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素的二次項(xiàng)以及提取時(shí)間與液料比的交互項(xiàng)都有顯著影響。

表3 回歸模擬方差分析

注：**P<0.01為極顯著；*P<0.05為顯著。

3.4 各因素的交互作用分析

各因素的交互作用如圖5所示。由圖5可以分析得出各個(gè)因素對(duì)月桂葉多糖得率的影響程度[8]。從3張圖對(duì)比之下我們可以很直觀得分析得出：3個(gè)因素中液料比月桂葉多糖得率的影響最大，表現(xiàn)為各個(gè)因素之間的交互作用中有液料比的，響應(yīng)曲面表現(xiàn)較陡峭，再由液料比與提取溫度的交互作用影響圖和液料比與提取時(shí)間交互作用影響圖進(jìn)行比較可以很直觀得看出圖液料比與提取溫度的交互作用響應(yīng)曲面較陡，從而得出提取溫度比提取時(shí)間對(duì)月桂葉多糖的得率影響更大。再?gòu)谋?中的F值中也能得到驗(yàn)證這3種因素影響程度大小順序分別為:C(液料比)>A(提取溫度)>B提取時(shí)間。

圖5 各因素之間交互作用影響以及月桂葉多糖得率的響應(yīng)曲面

3.5 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design expert8.0.6軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到最佳的月桂葉多糖提取條件為：溫度82.65℃,提取時(shí)間1.89 h，液料比15.35∶1，多糖得率預(yù)測(cè)值為1.4656%。但考慮到實(shí)際操作的局限性，把月桂葉多糖提取工藝修正為：提取溫度82℃，提取時(shí)間1.9 h，液料比16∶1，在修正條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可達(dá)到月桂葉多糖得率平均值為1.46%。與模型預(yù)測(cè)值相差不大，具有使用價(jià)值。多糖得率見表4。

表4 最佳提取條件及其驗(yàn)證

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析最終得到月桂葉多糖的提取條件，結(jié)果表明月桂葉多糖提取工藝參數(shù)為：溫度80℃，提取時(shí)間2 h，液料比16∶1,在此工藝下得到月桂葉多糖含量結(jié)果最佳。由響應(yīng)面分析中的方差分析以及各因素交互作用可知，影響月桂葉多糖提取條件因素主次順序C(液料比)>A(提取溫度)>B提取時(shí)間；建立了多糖得率的回歸模型，由該模型優(yōu)化的多糖最佳提取工藝條件為：溫度82℃，提取時(shí)間1.9 h，液料比16∶1,在此條件下得到月桂葉多糖含量為1.46%。