鄭佳東，周培培，戚玉若，官若楚，欒璐璐，付麗娜

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063)

黑木耳(Auricularia auricula)又稱云耳，是藥食兩用的大型真菌[1]。黃酮是黑木耳中主要活性成分，具有抗凝血、降血脂等多種功效，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[2]。超聲波輔助提取植物中有效成分的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，具有提取率高、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)以黑木耳為研究對(duì)象，利用超聲波輔助方法提取黑木耳黃酮，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以料液比、超聲溫度、超聲功率及乙醇濃度為考察因素，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化黑木耳黃酮的提取條件，為深度開發(fā)利用黑木耳資源提供科學(xué)依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳干品(產(chǎn)地：黑龍江牡丹江市)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(北京化學(xué)試劑公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇等試劑購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XFB-200型粉碎機(jī)：吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；3號(hào)藥典篩(孔徑0.36 mm，50目)、5號(hào)藥典篩(孔徑0.18 mm，80目)：浙江上虞市五四儀器篩具廠；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式多用真空泵：邦西儀器科技(上海)有限公司；遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳的預(yù)處理

將黑木耳洗凈，晾干，于烘箱中55℃干燥至恒重，粉碎，先后過(guò)3號(hào)和5號(hào)藥典篩、裝瓶備用[4]。

1.3.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置50 mL容量瓶，加75%的乙醇定容，搖勻，得0.5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6和7 mL分別放置于100 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，之后加4%NaOH溶液10 mL，定容，搖勻，靜置15 min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定吸光度A[5]。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=0.7605X+0.0574 ，R2=0.9993，說(shuō)明線性關(guān)系良好。

1.3.3 黃酮類化合物的測(cè)定

精密稱取2.0000 g干燥至恒重的黑木耳粉末，設(shè)置料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL)用(50%、60%、70%、80%、90%)乙醇溶解，定容，搖勻，于功率(50、60、70、80、90 W)、溫度(40、50、60、70、80℃)條件下超聲處理，冷卻，抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容，搖勻，移取10 mL分別放置于50 mL容量瓶中，然后加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1 mL，靜置10 min，搖勻，加入4%NaOH溶液10 mL定容，搖勻，靜置15 min，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定吸光度A[6]。

1.3.4 黑木耳黃酮類化合物的測(cè)定

采用NaNO2-Al (NO3)3顯色法，測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量。

黃酮提取率%=C×V×N×100/M；其中，式中，C為提取液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；N 為稀釋倍數(shù)；M 為粉末質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 最佳料液比的確定

固定溫度60℃、功率100 W、乙醇濃度80%，設(shè)置料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)5個(gè)水平，按照1.3.3方法測(cè)定黑木耳中黃酮的提取率，結(jié)果如圖2。

圖2 料液比對(duì)黑木耳黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

由圖2得出，隨著料液比的增加黃酮提取率出現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢(shì)。可能是因?yàn)槿軇┝刻贂r(shí)，黃酮的溶出量較少，之后慢慢增加，但溶劑量過(guò)大時(shí)雜質(zhì)的溶出也會(huì)增加，導(dǎo)致提取率降低[7]，因此將最佳料液比確定為1∶6。

2.1.2 超聲溫度的選擇

固定料液比1∶6、功率100 W、乙醇濃度80%，設(shè)置超聲溫度分別為40、50、60、70、80℃共5個(gè)水平，按照1.3.3方法測(cè)定黑木耳中黃酮的提取率，結(jié)果如圖3。

從圖3可知，隨溫度的升高黃酮提取率不斷升高，在60℃時(shí)提取率最高，之后提取率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于提取溫度過(guò)高時(shí)，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)受到破壞，因此選擇60℃為提取黑木耳黃酮的最佳溫度[8]。

圖3 超聲溫度對(duì)黑木耳黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

2.1.3 超聲功率的選擇

固定料液比1∶6、溫度60℃、乙醇濃度80%，設(shè)置超聲溫度分別為50、60、70、80、90 W共5個(gè)水平，按照1.3.3方法測(cè)定黑木耳中黃酮的提取率，結(jié)果如圖4。

圖4 超聲功率對(duì)黑木耳黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

從圖4可以看出，黃酮的提取率隨著超聲功率的增加而升高，在超聲功率為80 W時(shí)提取率最高，超聲功率超過(guò)80 W時(shí)提取率明顯減少，因此將最佳超聲功率確定為80 W。

2.1.4 乙醇濃度的選擇

圖5 乙醇濃度對(duì)黑木耳黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

固定料液比1∶6、溫度60℃、功率80 W，設(shè)置超聲溫度分別為50%、60%、70%、80%、90%共5個(gè)水平，按照1.3.3方法測(cè)定黑木耳中黃酮的提取率，結(jié)果如圖5。

從圖5看出，隨著乙醇濃度的增加黃酮的提取率也在不斷增加，在乙醇濃度為80%時(shí)提取率達(dá)到最高，而后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，所以選擇最佳超聲功率為80%。

2.2 正交試驗(yàn)

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Orthogonal experiment results and analysis table

對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，影響黃酮提取率的因素順序依次是乙醇濃度、超聲功率、溫度、料液比，其中乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響最大。從表中的極差值分析出最佳提取條件為∶料液比1∶6、溫度70℃、功率70 W、乙醇濃度75%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

表2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Verification testing results

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，在最佳提取條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，即料液比1∶6(g/mL)、超聲溫度70℃、超聲功率70 W、乙醇濃度75%(表2)，得到平均提取率為0.92%，RSD=1.081%，結(jié)果顯示離散程度小，即精密度高、結(jié)果重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)考察料液比、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度對(duì)黑木耳中黃酮提取率的影響，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，最終確定超聲波輔助提取黑木耳黃酮的最佳條件為：料液比1∶6(g/mL)、超聲溫度70℃、超聲功率70 W、乙醇濃度75%，提取率為0.92%。在該提取工藝條件下黃酮提取率較高，利用超聲波輔助提取方法減少了資源消耗，節(jié)省了時(shí)間，該項(xiàng)研究為進(jìn)一步開發(fā)黑木耳資源提供了科學(xué)依據(jù)。