鄭雙 符竣惠 章孟 章靈敏 林峰

結(jié)直腸癌作為最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)有著極高的病死率[1-2]。近年來(lái)，結(jié)腸癌外科手術(shù)、化療藥物以及小分子靶向藥物治療方面取得了很大進(jìn)展[3]，早期結(jié)腸癌的治療效果得到了一定程度的改善。因此，開(kāi)發(fā)新的結(jié)直腸癌診斷方法，揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制是結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究領(lǐng)域現(xiàn)階段的重點(diǎn)問(wèn)題。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）通常指長(zhǎng)度超過(guò)200nt的非編碼RNA。LncRNA的堿基在長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)上與信使RNA（messenger RNA,mRNA）非常類(lèi)似，但由于缺少開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）而不能被編碼翻譯成蛋白。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA非但不是在生物進(jìn)化過(guò)程中的基因冗余，而且在個(gè)體發(fā)育和癌癥等疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[4]。因此，以lncRNA作為新的腫瘤標(biāo)志物及抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的研究成為最近腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。AK001058是最近發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)的lncRNA，其在胃癌、結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)[5-6]，但在腫瘤發(fā)生（尤其是結(jié)腸癌）中的作用還缺少深入的研究。在本文中，筆者研究lncRNA AK001058在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017年7月至2018年10月本院3例結(jié)腸癌手術(shù)患者（TNM分期Ⅱ~Ⅲ級(jí)，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）的結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣≥5cm）。人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；FBS（500ml，批號(hào)：10099-141）和 DMEM 培養(yǎng)基（500ml，批號(hào)：11965-092）、消化細(xì)胞所用的 PBS（500ml，批號(hào)：14190-144）和 0.25%胰蛋白酶（500ml，批號(hào)：25200072）、轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用的 Opti-MEM 培養(yǎng)基（500ml，批號(hào)：31985062）和 Lipofectamine RNAiMAX（0.75ml，批號(hào)：13778150）轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染前1d將細(xì)胞接種于12孔板中，直到細(xì)胞融合度達(dá)到60%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在準(zhǔn)備好的2管Opti-MEM中分別加入1μl siRNA和 1μl Lipofectamine RNAiMAX，然后將稀釋的混合液于室溫靜置5min，采用懸滴法將其加入細(xì)胞，48h后進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)AK001058核苷酸序列設(shè)計(jì)了兩條siRNAs即siRNA-1和siRNA-2，并使用靶向熒光素酶（luciferase）的siRNA作為對(duì)照siRNA，其引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 siRNAs序列

1.2.2 癌組織和SW480細(xì)胞AK001058的表達(dá) 采用Trizol法提取組織或細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度之后將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后利用 SYBR Premix Ex Tag（Takara）在A(yíng)BI 7500儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序設(shè)為 95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 15s、65℃退火 15s、72℃延伸30s共35個(gè)循環(huán)。AK001058及內(nèi)參基因U6引物見(jiàn)表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 將消化好的細(xì)胞制成濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液，取100μl加入96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染對(duì)照 siRNA 和 siRNA-1、siRNA-2，并在轉(zhuǎn)染 0、24、48、72和96h 5個(gè)時(shí)點(diǎn)加入含CCK-8的培養(yǎng)基（約占原培養(yǎng)基體積的10%），37℃孵育4h，待顏色變橙色后拿出來(lái)放置在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V/PI雙染法。轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細(xì)胞培養(yǎng)48h后，使用0.25%Tripsin/EDTA消化細(xì)胞，并收集細(xì)胞用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。然后取500μl樣品加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl碘化丙啶（PI），輕輕混勻后室溫避光孵育10min，隨后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中AK001058表達(dá)水平的比較 與癌旁組織中AK001058的表達(dá)水平（1.00±0.12）相比，結(jié)腸癌組織中的（2.58±0.37）明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 對(duì)照siRNA、siRNA-1和siRNA-2 AK001058表達(dá)水平的比較 與對(duì)照siRNA的細(xì)胞中AK001058的表達(dá)水平（1.00±0.00）相比，siRNA-1（0.62±0.09）和 siRNA-2（0.54±0.05）的均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 對(duì)照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細(xì)胞增殖活性比較 與對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染后24、48h，siRNA-1和siRNA-2的細(xì)胞增殖活性相對(duì)較低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)染72、96h，siRNA-1和siRNA-2的細(xì)胞增殖活性均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 對(duì)照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細(xì)胞增殖活性比較

2.4 對(duì)照siRNA、siRNA-2和siRNA-2的SW480細(xì)胞凋亡率的比較與對(duì)照siRNA的細(xì)胞凋亡率[（2.60±0.72）%]相比，轉(zhuǎn)染siRNA-1[（6.81±2.01）%]和siRNA-2[（9.23±2.53）%]的均上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

開(kāi)發(fā)新的腫瘤標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)是當(dāng)前結(jié)腸癌基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，lncRNA在腫瘤發(fā)生中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。在結(jié)腸癌的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列具有重要作用的lncRNA會(huì)在腫瘤發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)異常表達(dá)，有些（如 CCAT1[7]、CCAT2[8]、MYLKP1[9]等）在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)出原癌基因的特性，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而有些則在癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。Niu等[6]發(fā)現(xiàn)了AK001058在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，但其在腫瘤發(fā)生中的作用卻沒(méi)有進(jìn)行深入的研究。在本研究中，筆者同樣使用結(jié)腸癌病理組織樣品，采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法驗(yàn)證了AK001058在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示AK001058在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，該結(jié)果提示AK001058可能在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的生理意義。進(jìn)一步以結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)下調(diào)AK001058的表達(dá)會(huì)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞走向凋亡。這些結(jié)果表明在結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，AK001058發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用。

lncRNA并不具有轉(zhuǎn)錄活性，卻可以通過(guò)與特定的蛋白、DNA或RNA結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性或者作為骨架聯(lián)系多種蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理功能的調(diào)控[10]。已有的研究表明，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，lncRNA可以直接參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，如DNA損傷活化P21相關(guān)非編碼RNA（P21 associated ncRNA DNA damage activated，PANDA）可以與轉(zhuǎn)錄因子NF-YA結(jié)合從而抑制DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡[11]。而在肝癌中，過(guò)表達(dá)PANDA也促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖[12]。lncRNA還可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，如基因間長(zhǎng)非編碼RNA-RoR（Linc-RoR）可以與核不均一核糖核蛋白（hnRNP）及AU富集元件RNA結(jié)合蛋白1（AUF1）相互作用，影響癌基因c-myc mRNA的穩(wěn)定性[13]。此外，越來(lái)越多的研究也發(fā)現(xiàn)了lncRNA參與了諸如 p53[14]、NF-κB[15-16]、PI3K/AKT[17]及 Notch[18]等多條腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路的調(diào)控作用，表明lncRNA可以多維度參與腫瘤發(fā)生的調(diào)控。

本研究結(jié)果提示了lncRNA AK001058對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，但未深入研究其調(diào)控的下游基因以及信號(hào)通路，因此AK001058在結(jié)腸癌細(xì)胞中具體作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。