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        重組人甲狀旁腺激素1-34對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎的改善作用

        2019-09-24 18:30:46王羅春洪敏
        上海醫(yī)藥 2019年15期
        關(guān)鍵詞:豚鼠生理鹽水月齡

        王羅春 洪敏

        摘 要 目的:評估重組人甲狀旁腺激素1-34(PTH1-34)對豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的作用。方法:采用6月或10月齡豚鼠,每天皮下注射生理鹽水或PTH1-34或復(fù)泰奧3個月,考察II型膠原C端肽CTX-2、骨鈣素OC、組織病理學(xué)OARSI評分、骨體積分數(shù)BV/TV及骨小梁模式因子Tb.pf等指標。結(jié)果:6月齡豚鼠給藥后,PTH1-34或復(fù)泰奧可降低CTX-2水平、OARSI評分、Tb.pf,提高BV/TV,對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎有改善作用;PTH1-34 30及60 mg/kg改善明顯,停藥1個月后30 mg/kg組仍可見明顯骨改善。10月齡豚鼠PTH1-34給藥后雌性動物Tb.pf明顯低于對照,認為存在骨改善。結(jié)論:PTH1-34對6月齡豚鼠骨關(guān)節(jié)炎有明顯改善作用,對10月齡豚鼠也有一定程度骨質(zhì)量改善。

        關(guān)鍵詞 骨關(guān)節(jié)炎 重組人甲狀旁腺激素1-34 復(fù)泰奧

        中圖分類號:R977.14; R965 文獻標志碼:A 文章編號:1006-1533(2019)15-0103-05

        Effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 on osteoarthritis in guinea pigs*

        WANG Luochun1**, HONG Min2

        (1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China; 2. National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research / Shanghai InnoStar Bio-Tech Co., Ltd., Shanghai 201203, China)

        ABSTRACT Objective: To evaluate the effects of recombinant human parathyroid hormone 1-34 (PTH1-34) on spontaneous osteoarthritis in guinea pigs. Methods: Six or ten months-old guinea pigs were subcutaneously injected daily with saline, PTH1-34 or Forsteo for 3 months. The changes of C-telopeptides of type II collagen (CTX-2), osteocalcin (OC), histopathological OARSI score, bone volume fraction BV/TV, and bone trabecular pattern factor Tb.pf were observed. Results: CTX-2 levels, OARSI score and Tb.pf were decreased while BV/TV was increased in 6-month-old guinea pigs after administration of PTH1-34 or Forsteo compared with saline control, which indicated that PTH1-34 or Forsteo could improve guinea pig osteoarthritis and furthermore, the improvement was more significant in guinea pigs with PTH1-34 dosage 30 or 60 mg/kg. Bone improvement was still visible in guinea pigs with PTH1-34 30 mg/kg after 1 month recovery. The Tb.pf level in female 10 months-old guinea pigs was significantly lower than that of the control after PTH1-34 was administered, which was considered that there existed bone improvement. Conclusion: PTH1-34 has a significant improvement effect on spontaneous osteoarthritis in 6 months old guinea pigs, while only a certain degree of improvement in 10 months old guinea pigs.

        KEy WORDS osteoarthritis; recombinant human parathyroid hormone 1-34; Forsteo

        骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨病變而導(dǎo)致以關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的退行性疾病,嚴重影響生活質(zhì)量。OA發(fā)生與年齡相關(guān),中老年人發(fā)病率高,65歲以上人群50%以上為OA患者。目前OA藥物治療如鎮(zhèn)痛藥物、關(guān)節(jié)腔注射藥物等,仍然是以緩解疼痛、延緩疾病進展為主,無法有效治療或改善骨關(guān)節(jié)炎疾病進程[1,2]。

        以重組人甲狀旁腺激素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34, rhPTH1-34)為活性成分的上市產(chǎn)品復(fù)泰奧(FORSTEO, teriparatide)是美國禮來公司研發(fā),用于治療骨質(zhì)疏松的生物藥物[3,4]。研究表明,復(fù)泰奧對模型大鼠、小鼠、猴、或兔的骨損傷或關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)都具有較好的作用,目前復(fù)泰奧正被用于一項治療OA的Ⅱ期臨床探索性研究[5-9]。豚鼠2月齡膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常,3月齡開始病變,4~6月齡骨關(guān)節(jié)炎逐步加重,9月齡關(guān)節(jié)軟骨逐步降解,因此豚鼠隨月齡自然發(fā)生的骨關(guān)節(jié)炎是與人骨關(guān)節(jié)炎病變機制最為接近的動物模型[10-13]。本研究考察重組人甲狀旁腺激素1-34注射液(PTH1-34)對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎的改善情況,以便為本品新藥開發(fā)臨床研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試藥物

        重組人甲狀旁腺激素1-34(簡稱PTH1-34)(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司研制,無色澄清液體,批號20140501、20141001、20141101);復(fù)泰奧(Eli Lilly and Company市售,無色澄清液體,批號C104325E、C174138D)。每日給藥前將供試藥物用滅菌生理鹽水稀釋至適當濃度,置2~8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 實驗動物

        豚鼠為Hartley-Dunkin品系,SPF級,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號11400700049877(雌性)、11400700050386(雄性);豚鼠骨關(guān)節(jié)炎隨月齡自然發(fā)生。

        1.3 關(guān)鍵實驗器材

        SkyScan1076型Micro CT(比利時Skyscan 公司)。

        1.4 動物分組與給藥劑量

        實驗動物分組及給藥情況詳見表1;實驗共分8組,采用不對稱設(shè)計。第1~5組為6月齡豚鼠,以隨機分組方式減少組間差異,分別皮下注射生理鹽水或PTH1-34 15、30或60 mg/kg或復(fù)泰奧30 mg/kg,每天一次,給藥3個月后考察;生理鹽水和PTH1-34 30 mg/kg組恢復(fù)1個月后再次考察。第6~8組為10月齡豚鼠,隨機分組,分別皮下注射生理鹽水或PTH1-34 15或30 mg/kg,每天一次,給藥3個月后考察。

        1.5 考察指標及方法

        1)Ⅱ型膠原C端肽(CTX-2) 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5~6只動物全血各約1 ml,分離血清,用 Mybiosource公司ELISA 試劑盒檢測[14]。

        2)骨鈣素(osteocalcin,OC) 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5~6只動物全血各約1 ml,分離血清,用Mybiosource公司ELISA試劑盒檢測[15]。

        3)組織病理學(xué)評分(OARSI評分) 豚鼠給藥后各組各期隨機采集4~5只動物膝關(guān)節(jié)標本進行關(guān)節(jié)軟組織連續(xù)切片,再用Safranin O Fast Green染色來評估OARSI評分[16]。

        4)骨體積分數(shù)(BV/TV)和骨小梁模式因子(Tb. pf) 豚鼠給藥后各組各期隨機采集5~6只動物膝關(guān)節(jié)標本進行Micro CT掃描,獲得BV/TV和Tb.pf參數(shù)結(jié)果[17]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 CTX-2檢測

        CTX-2反映軟骨損傷,6月齡豚鼠給藥各組各期隨時間進展CTX-2逐漸升高;10月齡豚鼠由于骨關(guān)節(jié)炎進展嚴重(與2.3、2.4結(jié)果相印證)未見CTX-2與時間的相關(guān)性。總體上,該指標結(jié)果反映了與月齡相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎進程(表2、表3)。

        6月齡豚鼠連續(xù)給予PTH1-34或復(fù)泰奧3個月后,雌性動物CTX-2水平呈降低趨勢,停藥1個月后仍可見藥效作用;雄性動物未見明顯改變。10月齡豚鼠由于動物骨關(guān)節(jié)炎進展嚴重,檢測數(shù)據(jù)變異度較大,各組間未見統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

        2.2 OC檢測

        OC水平變化反映成骨細胞的活性和骨轉(zhuǎn)換的程度,總體上OC水平在豚鼠骨關(guān)節(jié)炎中變化不明顯。但是,部分豚鼠(如6月齡雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg組、復(fù)泰奧30 mg/kg組,及10月齡雄性豚鼠PTH1-34 15 mg/kg組)給藥3個月后,OC水平比同期生理鹽水組都有所提高,提示有改善作用。(表4、表5)。

        2.3 組織病理學(xué)OARSI評分

        OARSI評分(等于Grade×Stage)反映關(guān)節(jié)軟骨損傷的程度,6月齡豚鼠生理鹽水組Grade、Stage、及OARSI評分值均隨著時間推移而升高,反映了6月齡豚鼠給藥3個月及恢復(fù)1個月的骨關(guān)節(jié)炎進程(表6~表8)。

        6月齡豚鼠PTH1-34 30 mg/kg組給藥2個月后, OARSI分值出現(xiàn)改善趨勢,雌性動物改善50%~80%,雄性動物則改善較??;給藥3個月,PTH1-34各劑量組及復(fù)泰奧組雌雄動物均出現(xiàn)改善趨勢,其中PTH1-34 15 mg/kg組改善10%~30%,其它給藥組改善50%~85%?;謴?fù)期1個月時,可能由于豚鼠骨關(guān)節(jié)炎進展嚴重,組間變化程度相當。

        10月齡豚鼠由于骨關(guān)節(jié)炎進展程度嚴重,鏡下難以判斷OARSI分值差異(表9)。總之,6月齡豚鼠連續(xù)給予PTH1-34或復(fù)泰奧2~3個月,對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的進展有一定的改善作用。

        2.4 BV/TV和Tb.pf的參數(shù)

        BV/TV反映骨形成的代謝狀況,Tb.pf反映成骨質(zhì)量(Tb.pf數(shù)值與骨質(zhì)量成反比),6月齡豚鼠生理鹽水組雌性和雄性動物的TV/BV和Tb.pf各期間無明顯變化,反映對照組動物在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中骨形成和骨質(zhì)量均維持在同一水平(表10、表11)。

        6月齡豚鼠PTH1-34或復(fù)泰奧給藥后各組各期,BV/TV均明顯升高,Tb.pf均明顯低于同期生理鹽水組,即骨質(zhì)量明顯提高。恢復(fù)期1個月仍可見藥效學(xué)作用。 10月齡豚鼠PTH1-34給藥3個月均可見BV/TV有升高和Tb.pf有下降的趨勢;但是由于動物變異度較大,僅雌性動物Tb.pf存在統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(表12)。

        3 討論

        6月齡豚鼠PTH1-34 30 mg/kg給藥2個月后CTX-2水平均高于生理鹽水組,機制尚不清楚。

        10月齡豚鼠給藥后,出現(xiàn)多組給藥1個月CTX-2數(shù)據(jù)高于本組給藥3個月的結(jié)果,組內(nèi)差異度大于均值,組間數(shù)據(jù)變化較大、沒有規(guī)律(表3)。分析認為,這主要是由于在豚鼠骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生與進展過程中關(guān)節(jié)軟骨先是經(jīng)歷細胞肥大、增殖、和降解的過程,此時CTX-2隨病情進展而升高(6~9月齡);隨著病情加重,關(guān)節(jié)軟骨逐步消融,此時CTX-2達到高峰后迅速降低(10~12月齡)[16],因此會出現(xiàn)表中3個月結(jié)果低于1個月結(jié)果的情形。同時由于到后期各動物個體病情進展差異較大,導(dǎo)致組內(nèi)差異度大于均值、組間數(shù)據(jù)變化沒有規(guī)律。

        另外,本研究中各項考察指標各組各期的檢測結(jié)果差異度都比較大,這是由于各組內(nèi)動物個體骨關(guān)節(jié)炎進展差異所造成的。后續(xù)研究可以在動物隨機分組前,通過限定入組豚鼠的體重范圍、增加入組前早期骨關(guān)節(jié)炎生物標志物(如CTX2)檢測等措施來縮小個體差異,從而保障研究數(shù)據(jù)的均一性。

        總體而言,除骨鈣素OC指標不敏感外,CTX-2、OARSI評分、BV/TV、及Tb.pf均能較好地反映豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的進展,顯示PTH1-34或復(fù)泰奧對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎的治療或改善作用。6月齡豚鼠給藥后,CTX-2水平、OARSI評分(包括Grade和Stage)、BV/TV及 Tb.pf均顯示PTH1-34或復(fù)泰奧對豚鼠明顯的骨改善,其中15 mg/kg改善較少,30及60 mg/kg改善明顯,停藥1個月后PTH1-34 30 mg/kg組仍可見明顯的改善作用。10月齡豚鼠由于病程進展嚴重,給藥后CTX-2、ORASI評分均不能區(qū)分骨關(guān)節(jié)炎的改善情況;但是在MicroCT檢查中,PTH1-34 15及30 mg/kg組雌性動物的Tb.pf明顯低于對照組,認為存在骨改善。本試驗條件下,PTH1-34對6月齡豚鼠骨關(guān)節(jié)炎有明顯改善作用,對10月齡豚鼠也有一定程度的骨質(zhì)量改善。

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