張君誠，許曉穎鄒函卓，楊 琳

(1.天然藥物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004 2.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州350001)

龍腦樟(Cirmamonun camphora)是樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)亞熱帶闊葉林植物，富含右旋龍腦，龍腦又稱為天然冰片，是藥材和高級香料[1]，在化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，目前主要分布于江西吉安、湖南新晃等部分地區(qū)[2]。 近年來，以龍腦樟萜類有效成分合成相關(guān)的關(guān)鍵基因逐漸被挖掘，對挖掘的這些基因進行熒光定量分析，有助于闡明這些基因的功能，以及與萜類成分積累的關(guān)系。

Actin 又稱為肌動蛋白，是一種重要的細胞骨架蛋白。它在細胞的運動定位、細胞分裂、胞吞和胞吐作用、細胞內(nèi)囊泡運輸、細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、共生現(xiàn)象、細胞器的運動以及膜的循環(huán)利用中發(fā)揮著重要的作用[3-9]。 研究表明，Actin 基因基因編碼一類高度保守的蛋白，在植物的各器官、細胞和組織中的表達量相對比較恒定[10-12]，因此也經(jīng)常作為熒光定量分析的內(nèi)參基因參。Yan 和Shi 首次從高等植物中克隆得到 Actin 基因后[13]，研究人員從火龍果[14]、木薯[15]、芍藥[16]、茶樹[17]、蕙蘭[18]、玉蘭[19]、水稻等植物中克隆出該基因。然而龍腦樟Actin 基因的研究尚未見報道。本研究設(shè)計特異性引物，利用同源克隆的方法克隆出龍腦樟Actin 基因片段， 為Actin 基因作為內(nèi)參基因進行龍腦樟相關(guān)功能基因的表達差異研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

來自江西吉安移栽至三明種植一至二年生的龍腦樟葉片。

1.2 儀器和試劑

梯度 PCR 擴增儀（Eppendorf 5331 型）、試驗所用 OmniPlant RNA Kit 試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Es Taq MasterMix （含 Es Taq DNA Polymetase、2×Es Taq PCR Buffer、3 mM MgCl、400 μM dNTP mix、染料）、快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，上述試劑盒均來源于北京康為世紀生物科技有限公司，其余試劑采用國產(chǎn)分析純。

1.3 龍腦樟葉片總RNA提取及cDNA的合成

龍腦樟葉片總RNA 的提取方法采用北京康為世紀生物科技有限公司OmniPlant RNA Kit 試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作，提取的總RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用cDNA 合成試劑盒（HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒）對龍腦樟葉片總RNA 進行cDNA 的合成。 按照試劑盒說明書進行操作，合成的cDNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 龍腦樟Actin基因克隆

根據(jù)NCBI 上已發(fā)表的香樟Actin(ACTc)基因（GenBank：KM086738.1）核苷酸序列的特異區(qū)域，利用 Primer5.0 軟件設(shè)計 PCR 特異引物， 序列分別為 5'-TGTTCTGGACTCGGGTGA-3' / 5'-ATGGATTCCTGCTGCTTC-3'。 PCR 反應(yīng)程序為：預(yù)變性 94 ℃，5 min；變性 94 ℃，30 s，退火 52 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1 min，共 30 個循環(huán)；終延伸 72 ℃，10 min。 1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。

1.5 序列分析

在NCBI 中通過BLAST/P 對已得到的龍腦樟核苷酸序列片段以及推導(dǎo)的氨基酸序列的理化性質(zhì)、三級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測。并與GenBank 中下載香樟、山雞椒、白玉蘭、鱷梨等植物的Actin 基因的氨基酸序列進行多序列比對，利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍腦樟Actin基因擴增

RNA 電泳結(jié)果（見圖1A）表明，28S 和 18S 條帶清晰，且 28S 的 RNA 條帶亮度約為18S 的 RNA條帶亮度的2 倍，說明提取的RNA 完整性良好，可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄成cDNA 結(jié)果顯示，合成的cDNA 在1000 至100 bp 之間呈彌散狀分布，說明反轉(zhuǎn)錄的效果較好，可以用于后續(xù)龍腦樟Actin 基因的克隆試驗（見圖1B）。根據(jù)同源擴增設(shè)計的特異引物，以總RNA 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳分離出特異片段，片段大小在250 與500 bp 之間（圖片1C）。

圖1 龍腦樟Actin 基因片段的擴增

2.2 龍腦樟Actin基因序列

對特異片段的序列分析結(jié)果， 獲得龍腦樟333 bp 的Actin 基因序列。 利用DNAMAN 對龍腦樟Actin 基因片段的核苷酸序列進行氨基酸序列推導(dǎo)， 該序列編碼110 個氨基酸 （如圖2A）。 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)蛋白的分子量12.37 kDa，等電點Ph 5.03，總平均疏水性指數(shù)（Grand average hydropathicity， GRAVY）-0.312 （小于 0）。 二級結(jié)構(gòu)中 α 螺旋、β 片層和無規(guī)則卷曲的比例分別為 40.04%、10.09%和45.87%。 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)如圖2B 所示。

圖2 龍腦樟Actin 基因推導(dǎo)的氨基酸序列及預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)

2.3 龍腦樟Actin蛋白多序列比對

利用DNAMAN 將本研究的龍腦樟Actin 基因片段及推定蛋白與特定序列進行多序列比對。 龍腦樟Actin 基因推定的氨基酸序列與擬南芥、香樟、山雞椒、白玉蘭、玉米、水稻、鱷梨、胡楊的相似性均在 85%以上， 其中與山雞椒 （GenBank 登錄號 KF706373.1) 和香樟 Actin 基因 （GenBank 登錄號KM086738.1）相似度都高達 93%（圖3）。

圖3 龍腦樟Actin 蛋白的多序列比對

2.4 龍腦樟Actin蛋白發(fā)生關(guān)系樹分析

11 種植物Actin 蛋白的進化樹分析表明， 龍腦樟與香樟、山雞椒的Actin 蛋白具有較高的同源性（圖4）。

圖4 11 種植物推導(dǎo)Actin 蛋白的進化樹

3 討論

Actin 基因是一種起源比較早的基因，研究表明，Actin 基因的核苷酸序列在高等植物中是相當(dāng)保守的， 并且在哺乳動物和植物之間大約有90%的相似性[20]。Actin 基因家族是植物表達研究中使用次數(shù)最多的管家基因。 本研究通過同源克隆的方法，得到龍腦樟333 bp 長度的Actin 基因片段。該片段編碼110 個氨基酸， 蛋白分子量為12.37 ku， 理論等電點為5.03，平均疏水性（GRAVY）為-0.312，α 螺旋、β 片層和無規(guī)則卷曲的比例分別為40.04 %、10.09%和45.87%。同源比對和進化樹分析結(jié)果都表明，龍腦樟與香樟、山雞椒的親緣關(guān)系最近，聚為一支；與木蘭科的白玉蘭、樟科的鱷梨、楊柳科的胡楊的親緣關(guān)系次之。該基因的進化關(guān)系符合真實物種間的進化順序。 龍腦樟Actin 基因序列的克隆，不僅為研究龍腦樟及其近源物種的系統(tǒng)發(fā)生提供參考，也為后續(xù)的量化基因表達研究奠定基礎(chǔ)。