鄢樹楓，黃曉晨，邢建宏，劉希華，張君誠

（1.三明學(xué)院 藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004；2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004；3.中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所，福建 福州 350002）

當(dāng)前，癌癥仍然是廣泛威脅人類健康的重大疾病之一，每年都造成全世界大量的患者死亡。 針對癌癥治療，外科手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)療法是目前臨床應(yīng)用中傳統(tǒng)的三種方式。 光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是一種新型的腫瘤治療方法，主要是利用光敏劑在有氧條件下被特殊波長的光激發(fā)后，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧。 相比于傳統(tǒng)的癌癥治療方式，光動力療法是一種微創(chuàng)、幾乎沒有副作用的新療法。 目前，光動力療法已經(jīng)被證實可作為高效的抗腫瘤治療手段，在科研和臨床上都有較廣泛的探索和應(yīng)用[1-2]。 光動力療法的療效主要依賴于光敏劑，不同的光敏劑具有的激發(fā)波長、單態(tài)氧產(chǎn)率和細(xì)胞毒性等各不相同。 迄今為止，只有少數(shù)幾種光敏劑得到官方批準(zhǔn)上市應(yīng)用[3-5]。 本文在前期化學(xué)合成ZnPc(TAP)4光敏劑的基礎(chǔ)上[6]，進一步研究ZnPc(TAP)4光敏劑的光化學(xué)性質(zhì)、單線態(tài)氧產(chǎn)量以及對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇毒性，以期為光動力抗腫瘤治療提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗相關(guān)試劑主要購買于阿爾法化工有限公司、西格瑪奧德里公司和百靈威公司等。 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 由中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所提供。DCFH-DA 單線態(tài)氧探針、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、胎牛血清、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液等細(xì)胞相關(guān)試劑和耗材購買于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性分析

ZnPc(TAP)4光敏劑中帶有12 個二甲氨甲基基團，對于溶液的pH 值較敏感。 根據(jù)磷酸鹽緩沖液配方表，配置不同pH 的磷酸鹽緩沖液，將ZnPc(TAP)4光敏劑溶解在相應(yīng)的pH 緩沖液里，再分別用Synergy 4 TM 混合式多功能讀板機采集各個孔的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜， 其中熒光檢測選擇610 nm 波長激發(fā)，檢測ZnPc(TAP)4光敏劑在635～900 nm 波段的熒光圖譜。 用軟件繪制不同pH條件下的紫外吸收和熒光圖譜。

磷酸鹽緩沖液配方見表1。母液的配制：0.2 mol/L Na2HPO4： 稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O， 溶 于 1 000 mL 水 ；0.2 mol/L NaH2PO4： 稱 取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于 1 000 mL 水。

表1 磷酸鹽緩沖液配方表

1.2.2 不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量

為測定ZnPc(TAP)4 光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量情況，選擇2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）為單線態(tài)氧檢測探針。 體系中有單線態(tài)氧產(chǎn)生時，DCFH-DA 可轉(zhuǎn)變?yōu)?DCF（2，7-二氯熒光素），DCF 經(jīng)400 nm 波長光激發(fā)，在528 nm 波長處有特征熒光產(chǎn)生。 因而，檢測528 nm 波長特征熒光的強度可推算體系單線態(tài)氧產(chǎn)量。設(shè)定不同pH 條件下的光照組和空白對照組，體系中加入過量的DCFH-DA探針。 不同pH 條件的光照組每隔30 s 光照一次， 并且在光照后立即檢測于酶標(biāo)儀中檢測熒光值?？瞻讓φ战M則只孵育DCFH-DA 探針，不加入ZnPc(TAP)4光敏劑。 連續(xù)檢測3 min 后，匯集數(shù)據(jù)，用軟件繪制不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量曲線。

1.2.3 細(xì)胞的計數(shù)與觀察

取凍存于液氮中的人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF，復(fù)蘇后分別傳代培養(yǎng)，約2～3 代后的細(xì)胞在顯微鏡不同倍數(shù)下觀察細(xì)胞狀態(tài)。 貼壁細(xì)胞應(yīng)鋪滿80%以上T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，可保證實驗所需細(xì)胞數(shù)目。觀察細(xì)胞狀態(tài)良好時進行細(xì)胞消化傳代。細(xì)胞傳代：使用一次性無菌吸管吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面1～2 次，加入1 mL 預(yù)熱的胰蛋白酶溶液，37℃培養(yǎng)箱中靜置約1 分鐘。用一次性無菌吸管吸去細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的胰蛋白酶溶液，加入10 mL 新鮮、37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基，使用5 mL 移液槍吹打均勻細(xì)胞，盡可能將T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞全部吹打下來。 吸取部分細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中用于細(xì)胞計數(shù)，另取5 mL 新鮮、37℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液于T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，均勻后分別于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取分析

按上述方法，在生物顯微鏡低倍鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，加入適量新鮮、37 ℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至所需細(xì)胞實驗濃度（50 000 個/ mL），吹打均勻后將細(xì)胞均勻轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL 細(xì)胞懸液至終濃度為10 000 個細(xì)胞/孔，將細(xì)胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。設(shè)置人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 的攝取實驗組，每組設(shè)置4 個復(fù)孔以減小實驗誤差。 給予細(xì)胞賦予相同的藥物濃度（2 μmol/L），在不同的時間點（0、6、12 和 24 h）檢測ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量。 具體實驗步驟如下：到達(dá)檢測時間點后，將孔中培養(yǎng)基棄去，用無菌PBS 或無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3 次，加入200 μL 裂解液（主要成分為0.1 M NaOH / l% SDS）裂解1 h，使體系形成均一溶液。 在酶標(biāo)儀中測定細(xì)胞提取液的熒光信號，測定各實驗孔細(xì)胞的總蛋白量。 取實驗孔裂解液 20 μL 至 96 孔透明板，加入 200 μL BCA 工作液，室溫靜置 2 h，檢測 562 nm處紫外/可見吸收值。 根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算實驗孔細(xì)胞的總蛋白量。 用每毫克蛋白含有多少毫克的ZnPc(TAP)4光敏劑來表示細(xì)胞對藥物的攝取。1.2.5 ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞毒性分析

按前述方法，用生物顯微鏡低倍鏡觀察乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常HELF 細(xì)胞狀態(tài)。 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，分別加入適量新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至所需實驗細(xì)胞濃度（50 000 個/mL），吹打混勻后于細(xì)胞 96 孔板鋪板細(xì)胞，每孔加入 200 μL 細(xì)胞懸液（10 000 個/孔），于 37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過夜。 配置不同濃度的ZnPc(TAP)4光敏劑溶液備用。 根據(jù)實驗方案，設(shè)置不同濃度的實驗組（0.5， 1， 2， 4， 8 μmol/L）。 洗去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度 ZnPc(TAP)4光敏劑的培養(yǎng)基，藥物孵育2 h。 光敏劑孵育后，吸去細(xì)胞96 孔板培養(yǎng)孔內(nèi)原有的藥物培養(yǎng)液，加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗1 次，再 加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細(xì)胞培養(yǎng)液。 混勻后，使用680 nm、100 mW 光源對細(xì)胞培養(yǎng)板進行均勻光照1 min（光劑量2.5 J/cm2）。光照后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過夜。 24 h 后，利用MTT 法檢測細(xì)胞存活率。 MTT 全稱為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，MTT 比色法可以檢測細(xì)胞存活率。 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使外源性MTT 變成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，通常已死亡的細(xì)胞不存在這種現(xiàn)象。 此后利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定其光吸收值，計算出細(xì)胞的存活率、繪制細(xì)胞存活率曲線圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH靈敏性

酞菁類光敏劑在生物應(yīng)用過程中，藥物的自發(fā)聚集情況是不可忽視的一方面。 光敏劑聚集容易降低其單線態(tài)氧產(chǎn)量，降低了光動力抗腫瘤的治療效果[7]。 ZnPc(TAP)4光敏劑帶有12 個二甲氨甲基基團，pH 值的改變會影響其在水中的聚集程度。 配置不同pH 的緩沖液，研究ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性，分析ZnPc(TAP)4光敏劑的聚集情況有助于探索ZnPc(TAP)4光敏劑的活性。 結(jié)果如圖1 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外吸收最大峰位置隨緩沖液pH 值升高發(fā)生了移動，當(dāng)pH 值為8.0 時，Zn-Pc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位于650 nm 左右，光敏劑處于聚集狀態(tài)；當(dāng)pH 值降低至6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位轉(zhuǎn)移到690 nm 左右，光敏劑處于單體狀態(tài)。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應(yīng)性能。 同時，ZnPc(TAP)4光敏劑的熒光圖譜隨緩沖液pH 值的改變也發(fā)生了明顯變化：當(dāng)pH 值為 8.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值較?。划?dāng)pH 值降低至 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值顯著升高，達(dá)到6 000 左右，是pH 8.0 狀態(tài)熒光值的30 倍。 此差異主要由于其的活性狀態(tài)不同：pH 值為 8.0 時 ZnPc(TAP)4光敏劑處于聚集狀態(tài)，pH 值為 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)。 進一步證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個pH 單位內(nèi)快速轉(zhuǎn)變其活性，這一優(yōu)勢有利于提高藥物的生物利用度。 據(jù)文獻(xiàn)報道，人體內(nèi)的正常生理環(huán)境或正常細(xì)胞的細(xì)胞外pH 約為7.4，而腫瘤細(xì)胞環(huán)境因其缺氧、產(chǎn)生大量的代謝物，導(dǎo)致周邊腫瘤微環(huán)境維持偏酸性[8]，因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的靈敏pH 響應(yīng)、單體和聚集體快速轉(zhuǎn)換性能，有利于在抗腫瘤治療中提高藥物的利用度。 酞菁類光敏劑的熒光強度還與藥物的光敏活性有關(guān)，高強度的熒光有利于藥物對腫瘤進行光學(xué)成像，有助于腫瘤的診斷和治療[9-10]。

圖1 ZnPc(TAP)4 光敏劑的pH 靈敏性

2.2 ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH條件下的單線態(tài)氧產(chǎn)量

酞菁鋅光敏劑在特殊波長光照條件下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧，作用于周邊環(huán)境，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。 因此，檢測ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量具有重要意義。 實驗結(jié)果如圖2 所示。ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH 條件下均有單線態(tài)氧產(chǎn)生，且其單線態(tài)氧產(chǎn)量與pH 值的大小存在明顯的負(fù)相關(guān)。 在pH 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)量約是pH 8.0時的5 倍，證明ZnPc(TAP)4光敏劑在偏酸性環(huán)境中有更高的單線態(tài)氧產(chǎn)量。 結(jié)合ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外和熒光特性，單線態(tài)氧產(chǎn)量的差異主要與其在不同pH 值條件下單體-聚集體轉(zhuǎn)換性能有關(guān)。 pH 6.0 時ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)，能夠產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧，這有助于提高ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細(xì)胞毒性。

圖2 ZnPc(TAP)4 光敏劑在不同pH 條件下的單線態(tài)氧產(chǎn)量

2.3 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取分析

研究細(xì)胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量有助于分析藥物的細(xì)胞毒性能力。 尤其是腫瘤細(xì)胞，其攝取ZnPc(TAP)4光敏劑的能力與腫瘤細(xì)胞毒性密切相關(guān)。 本實驗研究人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞HELF 對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力。 實驗結(jié)果如圖3 所示。 正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力和藥物孵育時間呈現(xiàn)正相關(guān)性。 腫瘤細(xì)胞在前3 個小時快速ZnPc(TAP)4光敏劑，在12～24 h 區(qū)間仍然有顯著的藥物攝取。 相比于腫瘤細(xì)胞，正常細(xì)胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取要相對緩和，在前12 h 逐步攝取藥物，并且在12 h 后趨于穩(wěn)定， 達(dá)到攝取平臺期。實驗結(jié)果可證明相同的藥物濃度和孵育時間情況下， 腫瘤細(xì)胞對ZnPc(TAP)4的攝取能力明顯大于正常細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取量約是正常細(xì)胞的2～3 倍。 這可能是由于腫瘤細(xì)胞表面通常帶負(fù)電荷，ZnPc (TAP)4光敏劑能夠更好地吸附于腫瘤細(xì)胞并且被腫瘤細(xì)胞攝??；同時，在腫瘤微酸性環(huán)境中，ZnPc(TAP)4光敏劑呈現(xiàn)單體狀態(tài)，具有更好的藥物活性。

圖3 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取情況

2.4 ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性

對于光動力治療中使用的酞菁鋅光敏劑，最重要的評價指標(biāo)就是藥物的細(xì)胞毒性[11-12]。 本文選取正常的成纖維細(xì)胞HELF 和乳腺癌細(xì)胞MCF-7 來研究ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞毒性。 成纖維細(xì)胞HELF 和乳腺癌MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇活化至達(dá)到實驗要求， 將細(xì)胞接種于實驗板上。設(shè)置不同的藥物濃度梯度 0.5，1，2，4，8 μmol/L，用 MTT 法檢測細(xì)胞存活率。 實驗結(jié)果如圖4 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)對乳腺癌細(xì)胞MCF-7 具有明顯的腫瘤細(xì)胞毒性，在8 μmol/L 時就能夠使95%的腫瘤細(xì)胞死亡；相比于腫瘤細(xì)胞，ZnPc(TAP)4 光敏劑對成纖維細(xì)胞HELF 的細(xì)胞毒性顯著降低。 當(dāng)藥物濃度為2 μmol/L 時，ZnPc(TAP)4光敏劑對腫瘤細(xì)胞的毒性約是正常細(xì)胞的2～3 倍。這主要是由于腫瘤細(xì)胞在生長過程中產(chǎn)生的代謝物導(dǎo)致其處于微酸性環(huán)境， 而正常細(xì)胞的酸堿性相對平衡，處于偏中性的環(huán)境中。 ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤細(xì)胞的微酸性環(huán)境中維持單體狀態(tài)，其最大紫外吸收峰位于690 nm 左右，能夠產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，實現(xiàn)了高效的腫瘤細(xì)胞毒性。而在正常細(xì)胞環(huán)境中，大部分ZnPc(TAP)4光敏劑最大紫外吸收峰處于650 nm 的聚集體狀態(tài)，導(dǎo)致較少的單線態(tài)氧產(chǎn)量，降低了其對正常細(xì)胞的毒性。 因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的高靈敏pH響應(yīng)性能賦予其獨特的腫瘤細(xì)胞選擇毒性，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

圖4 ZnPc(TAP)4 光敏劑對細(xì)胞的毒性分析

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應(yīng)性能，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細(xì)胞的能力和較低的正常細(xì)胞毒性。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個pH 單位內(nèi)快速轉(zhuǎn)變其活性，有利于提高藥物的生物利用度：藥物在生理條件（生理pH 約7.4）下具有較低的細(xì)胞毒性，保證藥物的穩(wěn)定性和體內(nèi)安全運輸；當(dāng)藥物到達(dá)腫瘤微酸性環(huán)境時（腫瘤微環(huán)境pH 約 6.5），能夠從聚集態(tài)轉(zhuǎn)變成更有活性的單體狀態(tài)，實現(xiàn)更好的腫瘤細(xì)胞毒性作用。 同時，ZnPc(TAP)4光敏劑在微酸性環(huán)境中，其熒光顯著增強，有助于對體內(nèi)腫瘤進行光學(xué)成像和診斷。 目前國內(nèi)外已報道的應(yīng)用于臨床診斷的光敏劑藥物包括四環(huán)素、金絲桃素、血卟啉衍生物(HpD)、5-氨基酮戊酸(ALA)及其酯類衍生物氨基酮戊酸己酯( HAL) 等。其中5-氨基酮戊酸( ALA)/PpIX 熒光成像利用激光光敏技術(shù)可以看到發(fā)射紅色熒光的增生組織，可輔助病變定界、識別殘留病灶、提高照光成功率和減少復(fù)發(fā)[13]。雖然如此，目前絕大多數(shù)的光敏藥物在臨床治療和診斷過程中仍然面臨較大挑戰(zhàn)，本課題研究的ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤治療和熒光診斷方面具有鮮明特點，對于更好地推進光敏劑的臨床應(yīng)用具有一定的參考價值和前景。