劉婭迪， 陸瑞婷， 王迪芬

貴州省醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 ICU，貴州 貴陽 550001

腦卒中患者預后較差，常伴有認知功能障礙、偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1-2]。腦缺血再灌注產(chǎn)生的氧自由基及炎性因子是導致神經(jīng)元損傷及影響愈后的重要因素[3]。有研究表明，海馬神經(jīng)元損傷及細胞凋亡與氧化應激、炎癥反應密切相關，雌激素具有一定的神經(jīng)保護作用[4]。而雌激素是否通過改善氧自由基代謝、調(diào)控炎性因子水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用，具體機制尚不清楚。本研究參照文獻[5-6]方法，采用改良Longa線栓阻塞法建立右側(cè)大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模型，生化法測定腦組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)含量，免疫印跡法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表達，探討雌激素對腦組織的作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 選取雄性SD大鼠30只(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，鼠齡3～4個月，體質(zhì)量200～250 g，動物自由覓食、飲水，適應性喂養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法分為假手術組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)和雌激素組(E組)，每組 10 只。雌激素購自天津金耀氨基酸有限公司；SOD、MDA及CAT生化試劑盒購自南京建成生物有限公司；磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TNF-α、MCP-1和BDNF等兔抗大鼠一抗購自美國 Abcom公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid disodium,BCA)試劑盒購自武漢碧云天有限公司；蘇木素-伊紅染色(hematoxylineosin staining，HE)試劑盒購自天津百浩生物科技有限公司；線栓3600AAA購自廣州佳靈生物技術有限公司。

1.2 研究方法 造模前，E組腹腔注射雌激素10 μg/kg，E組和I/R 組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，于末次給藥1 h后開始造模，S組僅分離動脈血管，不結扎，不插線栓。E組和I/R 組采用改良Longa線栓阻塞法建立右側(cè)大腦中動脈閉塞局灶性腦缺學再灌注模型：(1)10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，頸部備皮、消毒、切開皮膚，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動脈。(2)于頸內(nèi)、外動脈分叉處結扎頸外動脈，近心端結扎頸總動脈。(3)動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，將線栓沿頸總動脈向頸內(nèi)動脈方向推入，至動脈夾夾閉處時松開動脈夾，經(jīng)頸內(nèi)動脈緩慢推入至大腦前動脈近端，約插入 18～22 mm。固定線栓，縫合傷口。120 min后回抽線栓至頸總動脈分叉處。實驗造模過程中及動物蘇醒期間注意保暖，避免大鼠死亡。

造模后24 h，用過量水合氯醛深度麻醉處死大鼠，斷頭冰下解剖大腦取腦組織。每組取4只大鼠腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，行石蠟包埋常規(guī)切片。HE染色后，觀察腦組織海馬區(qū)病理學改變，比較各組大鼠腦組織海馬神經(jīng)元損傷情況。取適量腦組織以1∶9的比例采用生理鹽水進行組織勻漿，4℃下離心10 min后取上清，測定各組大鼠腦組織重SOD、MDA及CAT含量。取海馬組織以1∶10的比例采用1%的苯甲磺酰氟裂解液勻漿提取蛋白樣品，4℃下離心10 min后取上清，BCA試劑盒測定蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加緩沖液沸水浴10 min，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?5 μl樣品上樣，通過10%SDS-P聚丙酰胺凝膠電泳跑膠分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。分別加入GAPDH、TNF-α、MCP-1和BDNF(1∶2 000，武漢安特捷有限公司)抗體4℃孵育過夜，次日加入二抗室溫孵育后，曝光顯影獲得蛋白條帶。

2 結果

2.1 3組腦組織病理改變 S組腦組織未見病理改變，海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊、形態(tài)正常、結構完整。I/R組海馬區(qū)則有明顯空泡樣病變，神經(jīng)細胞排列混亂、形態(tài)破裂、邊界模糊，有大量炎性細胞浸潤。E組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列有序、形態(tài)基本正常、結構較完整，病變較I/R組有明顯改善。見圖1。

2.2 3組SOD、MDA及CAT含量情況 I/R組、E組大鼠腦組織SOD、CAT較S組明顯降低，MDA顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E組SOD、CAT高于I/R組，MDA顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 3組大鼠腦組織病理結果(HE×200，a.S組；b.I/R組；c.E組)

2.3 3組大鼠腦組織TNF-α、MCP-1和BDNF蛋白表達 與S組比較，I/R組大鼠海馬區(qū)TNF-α和MCP-1蛋白水平明顯升高，而BDNF蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 與I/R組比較，E組大鼠海馬組織TNF-α和MCP-1表達下調(diào)，BDNF表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA及CAT含量變化

注：與S組比較，①P<0.05；與I/R組比較，②P<0.05

圖2 3組大鼠腦組織TNF-α、MCP-1和BDNF蛋白表達

3 討論

氧化應激、炎癥反應是加劇腦缺血-再灌注損傷的重要因素，氧自由基相關物質(zhì)SOD、MDA、CAT改變，炎性因子TNF-α、MCP-1的增加均會導致大腦海馬組織病變和神經(jīng)元損傷[6-8]。BDNF對維持神經(jīng)元功能具有重要作用，在腦缺血再灌注損傷中表達異常，進而激活相關信號通路，最終誘導神經(jīng)元細胞凋亡。雌激素對大鼠腦缺血再灌注有神經(jīng)保護作用[9]，但其具體機制仍不清楚，本研究通過檢測腦組織氧化應激相關物質(zhì)SOD、MDA、CAT含量，TNF-α、MCP-1及BDNF蛋白表達，探討雌激素對腦組織的保護作用。

I/R組病理結果證實，大鼠腦組織神經(jīng)元細胞破裂，發(fā)生空泡樣病變，大量炎性細胞浸潤，表明腦缺血再灌注損傷造模成功。E組海馬組織神經(jīng)細胞排列漸進有序，結構及形態(tài)基本接近正常，說明雌激素對缺血再灌注損傷組織具有保護作用，與相關報道一致[10-11]。缺血再灌注中產(chǎn)生大量氧自由基，進而損傷神經(jīng)細胞，MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，可間接反映細胞損傷的程度，而SOD和CAT具有清除氧自由基的作用，反映機體的抗氧化應激能力[12-13]。本研究生化結果顯示，I/R組大鼠腦組織中有害物質(zhì)MDA較S組明顯增多，且SOD、CAT降低；E組SOD、CAT水平較I/R組顯著升高，MDA含量減少，表明雌激素可抵御自由基造成的神經(jīng)細胞損傷，具有一定抗氧化應激作用。缺血缺氧刺激下，炎癥反應激活，大量釋放介導炎性因子參與機體免疫應答，有神經(jīng)毒性作用。與S組比較，I/R組大鼠海馬區(qū)TNF-α和MCP-1蛋白水平明顯升高，炎性細胞浸潤釋放炎性介質(zhì)導致神經(jīng)細胞壞死凋亡。E組TNF-α和MCP-1表達下調(diào)，炎癥反應得到抑制。

BDNF在腦缺血再灌注損傷中對維持海馬區(qū)神經(jīng)元活性及功能，抑制細胞凋亡發(fā)揮重要作用[8]。在大腦缺血、缺氧等刺激下，氧自由基大量釋放，炎癥反應被激活， I/R組BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達下調(diào)，進而介導后續(xù)信號通路及級聯(lián)反應，誘導神經(jīng)細胞凋亡。雌激素干預后，氧化應激及炎癥反應有所緩解，腦組織BDNF應激性上調(diào)，抑制神經(jīng)細胞凋亡[13]，本研究結果證實E組BDNF表達較I/R組明顯增加，海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及神經(jīng)細胞凋亡減少。

綜上所述，雌激素能改善腦缺血再灌注中氧化應激造成的損傷，通過減少MDA釋放，增加SOD、CAT水平，下調(diào)TNF-α、MCP-1，上調(diào)BDNF表達發(fā)揮抗炎及保護神經(jīng)元作用。