徐云鳳 吳 倩 樊秋霞 王 新 夏效東

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3. 綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000)

金黃色葡萄球菌是一類革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在自然界中廣泛存在，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求低、環(huán)境耐受性強(qiáng)[1]，可污染從農(nóng)田到餐桌的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的安全隱患。據(jù)報(bào)道[2]，2011～2016年，在中國(guó)由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食源性疾病爆發(fā)案例314起，患病人數(shù)5 196人，死亡1人，僅次于副溶血性弧菌和沙門氏菌，位居第3位。在美國(guó)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌被認(rèn)為是污染新鮮農(nóng)產(chǎn)品的最重要的食源性致病菌[3]。金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生多種毒力因子，例如溶血素、腸毒素、血漿凝固酶、毒性休克綜合征毒素等[4-5]。這些毒力因子主要為外毒素和侵襲性酶，或作為胞外蛋白分泌到環(huán)境中(包括食品基質(zhì))，或作為菌體表面蛋白在細(xì)菌侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮作用[6]。金黃色葡萄球菌致病性的強(qiáng)弱在很大程度上取決于其產(chǎn)生的毒力因子[7]，因此研究如何抑制和降低其毒力因子的表達(dá)是一個(gè)重要的課題。

近年來(lái)，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，此外，消費(fèi)者對(duì)合成防腐劑的安全性也存在質(zhì)疑，很多研究者[8]把目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物，尤其是植物源天然活性物質(zhì)上。許多植物化合物，如多酚類、萜類以及生物堿等，在體外研究中均被發(fā)現(xiàn)具有一定的抑制微生物生長(zhǎng)或毒力因子表達(dá)的作用[9-10]。因而從植物中探索安全有效的天然產(chǎn)物用于預(yù)防和控制食源性致病菌(如金黃色葡萄球菌)具有十分重要的意義。

安石榴苷是石榴皮中重要的生物活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，安石榴苷具有抑菌[11]、抗病毒[12]、抗氧化[13]、抗炎癥[14]、抗癌[15]等多種生物活性作用。前期研究[16]表明，安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果，最小抑菌濃度(MIC)為0.25 mg/mL，然而安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子的表達(dá)影響尚不清楚。試驗(yàn)擬對(duì)安石榴苷處理后的金黃色葡萄球菌的溶血活性、凝固酶活性和產(chǎn)腸毒素情況進(jìn)行測(cè)定，并采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)毒力基因的表達(dá)情況，以期為金黃色葡萄球菌的控制和安石榴苷的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

安石榴苷：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

金黃色葡萄球菌：ATCC 29213，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，保存于-80 ℃冰箱；

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、新鮮無(wú)菌脫纖維羊血、凍干兔血漿：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

無(wú)菌濾膜：0.22 μm孔徑，美國(guó)Millipore公司；

總腸毒素檢測(cè)試劑盒：德國(guó)R-Biopharm公司；

引物：上海捷瑞生物工程有限公司；

石英砂(二氧化硅)：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

溶菌酶：20 000 U/mg，美國(guó)Amresco公司；

溶葡萄球菌素、瓊脂糖：美國(guó)Sigma公司；

EasyTaq?DNA 聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

細(xì)菌總RNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒：寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：DPX-9082 B-2型，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

超凈工作臺(tái)：YT-CJ-IND型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

冷凍離心機(jī)：5804R型，德國(guó)Eppendorf公司；

PCR儀：9600型，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；

電泳儀：1645050型，美國(guó)Bio-Rad公司；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：iQ5型，美國(guó)Bio-Rad公司；

臺(tái)式恒溫振蕩器：TH2-312型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

酶標(biāo)儀：680型，美國(guó)Bio-Rad公司；

超微量核酸分析儀：Nano-200型，杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備 從冰箱取出金黃色葡萄球菌，于胰蛋白胨大豆瓊脂平板上活化培養(yǎng)。挑取單菌落于裝有腦心浸液培養(yǎng)基的試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。然后用新鮮無(wú)菌的腦心浸液培養(yǎng)基將菌懸液的吸光度調(diào)至OD600 nm=0.5(含菌量約為108CFU/mL)。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù) 采用梯度稀釋法將安石榴苷母液在無(wú)菌的10 mL離心管中進(jìn)行稀釋，使其濃度分別為0，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，2 MIC。加入等體積2倍濃度的腦心浸液培養(yǎng)基，使安石榴苷最終濃度為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，此時(shí)培養(yǎng)基的濃度變?yōu)?倍正常濃度。將上述菌懸液按照1%(體積分?jǐn)?shù))的接菌量接入到培養(yǎng)液中，混合均勻，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行系列10倍稀釋，涂板計(jì)數(shù)。

1.2.3 溶血活性的測(cè)定 參照Worlitzsch等[17]的方法測(cè)定溶血活性，修改如下：將上述菌懸液按1%的接菌量接入到含有安石榴苷的腦心浸液培養(yǎng)基中，使安石榴苷的終濃度分別為0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，37 ℃，130 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)24 h，12 000 r/min 離心5 min，將上清液用0.22 μm孔徑的無(wú)菌濾膜過(guò)濾。取475 μL過(guò)濾后的樣品上清液于1.5 mL離心管中，加入25 μL 無(wú)菌脫纖維羊血，輕搖混勻，37 ℃孵育2 h。3 000 r/min 離心1 min，吸取200 μL上清液，轉(zhuǎn)移到96孔板中，450 nm下測(cè)定其吸光值。以不含安石榴苷的菌懸液上清作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌腦心浸液培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)同樣處理后作為空白對(duì)照。

1.2.4 凝固酶效價(jià)的測(cè)定 吸取0.5 mL無(wú)菌生理鹽水加入到凍干血漿西林瓶中，搖勻使之充分溶解，再加入上述不同濃度安石榴苷處理的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液0.3 mL，混合均勻后于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置。在6 h以內(nèi)，每間隔1 h觀察1次結(jié)果，若出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，即認(rèn)為待測(cè)菌液的血漿凝固酶為陽(yáng)性，否則為陰性[18]。

1.2.5 總腸毒素的檢測(cè) 采用三明治(夾心)酶聯(lián)免疫反應(yīng)法[19]檢測(cè)安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌總腸毒素表達(dá)量的影響。樣品處理方式同1.2.3，取無(wú)菌濾液稀釋5倍后進(jìn)行檢測(cè)。將酶聯(lián)免疫試劑盒中所有試劑溫度恢復(fù)至室溫，然后于室溫下按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

將所需數(shù)量的微孔條插入到框架中，向每個(gè)微量滴定孔中加100 μL樣品或陽(yáng)性對(duì)照，輕搖混勻，包上封口膜，37 ℃孵育1 h；將液體全部倒掉，在吸水紙上輕輕拍打至傾倒完全，加入300 μL洗滌緩沖液，重復(fù)操作5次；加入100 μL酶連接物1溶液，用手輕輕搖動(dòng)使其混勻，封口，37 ℃再孵育1 h；重復(fù)洗滌步驟；加入100 μL酶連接物2溶液，輕搖混勻，封口，37 ℃孵育30 min；再次重復(fù)洗滌步驟；加入100 μL底物/發(fā)色劑，輕搖混勻，封口，在37 ℃ 下避光孵育15 min；加入100 μL反應(yīng)終止液，在30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光值。

1.2.6 qRT-PCR法檢測(cè)毒力基因的表達(dá)

(1) 引物序列及特異性檢測(cè)：引物序列參照Qiu等[20]所使用的序列。取1 mL在腦心浸液培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液，離心(12 000 r/min,2 min)，棄上清液，加入1 mL無(wú)菌水后于干浴器中100 ℃ 加熱煮沸20 min；4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min，并取上清液作為PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃、10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1 g/100 mL 的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，緩沖溶液為0.5 ×TBE。EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察在目標(biāo)位置有無(wú)條帶出現(xiàn)，且有無(wú)雜帶。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system μL

(2) RNA的提?。喊刺旄?xì)菌/細(xì)胞RNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)菌RNA的提取，由于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁比較厚，破碎困難，在操作中加入溶葡萄球菌素處理和石英砂震蕩破碎的步驟。

按上述方法進(jìn)行給藥處理，24 h后，取1 mL菌懸液于1.5 mL無(wú)RNA酶離心管中(離心管預(yù)先裝有20～30 mg 石英砂，并高壓滅菌處理)，12 000 r/min，4 ℃條件下離心2 min，棄上清，用無(wú)菌水洗滌1次；用含3 mg/mL溶菌酶的100 μL TE緩沖液重懸菌體，室溫孵育15 min；加入10 μg/mL溶葡萄球菌素3 μL，繼續(xù)孵育5 min；加入350 μL裂解液，渦旋振蕩1 min，冰浴2 min，重復(fù)5次，12 000 r/min離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入250 μL無(wú)水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱中，余下操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最終得到RNA溶液。用微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，將RNA的濃度調(diào)為一致。

(3) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

(4) RT-PCR：按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、 30 s，40個(gè)循環(huán)(熒光定量)；95 ℃、15 s，1個(gè)循環(huán)；60～90 ℃、30 s，71個(gè)循環(huán)(溶解曲線)。

毒力相關(guān)基因相對(duì)定量結(jié)果以16S rRNA作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法表示。ΔΔCt按式(1)計(jì)算。

ΔΔCt=(Ct4-Ct3)-(Ct2-Ct1)，

(1)

式中：

ΔΔCt——處理組和對(duì)照組之間校正過(guò)的循環(huán)數(shù)變化；

Ct4——安石榴苷處理組目的基因的平均Ct值；

Ct3——安石榴苷處理組內(nèi)參基因的平均Ct值；

隨著多媒體技術(shù)的發(fā)展，“互聯(lián)網(wǎng)+”時(shí)代的來(lái)臨引發(fā)了外語(yǔ)教學(xué)的教學(xué)理念、教學(xué)過(guò)程、教學(xué)活動(dòng)、教學(xué)方法和教學(xué)策略乃至教學(xué)目標(biāo)和教學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等諸多教學(xué)模式要素的改變。在這樣的背景下，語(yǔ)言教學(xué)應(yīng)利用一切符號(hào)手段促進(jìn)教學(xué)，激發(fā)學(xué)生興趣，讓交際不再是利用一種感官進(jìn)行，而是兩種或多種感官同時(shí)進(jìn)行。接下來(lái)將針對(duì)目前高職外貿(mào)函電課堂教學(xué)中所存在的主要問(wèn)題，從學(xué)生、教師和教材三個(gè)方面論述如何構(gòu)建多模態(tài)課堂。

Ct2——對(duì)照組目的基因的平均Ct值；

Ct1——對(duì)照組內(nèi)參基因的平均Ct值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析和處理數(shù)據(jù)，采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 安石榴苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)菌落計(jì)數(shù)得知，起始接菌量為(3.45±0.17)×106CFU/mL。培養(yǎng)24 h后，每個(gè)管內(nèi)的菌落數(shù)如表2所示，隨著安石榴苷濃度的增加，金黃色葡萄球菌的數(shù)量減少，安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，在低于1/8 MIC濃度下，安石榴苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響較小。

2.2 安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌溶血活性的影響

如圖1所示，安石榴苷能夠抑制金黃色葡萄球菌溶血素的產(chǎn)生。安石榴苷處理組的溶血活性與陽(yáng)性對(duì)照組相比顯著降低，且具有極顯著差異，只有在1/4 MIC濃度下與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，該濃度下所表現(xiàn)出的特異性的原因尚不清楚?？傊?，安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌的溶血活性有抑制作用，但抑制作用未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。溶血素作為一種外毒素是造成金黃色葡萄球菌感染的重要的毒力因子[21]，安石榴苷能夠降低溶血素的表達(dá)，具有潛在的抗感染作用。

表2 菌落計(jì)數(shù)Table 2 Cell enumeration CFU/mL

**表示與對(duì)照組相比，具有極顯著差異

2.3 安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌凝固酶表達(dá)的影響

向血漿中加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液后，每隔1 h輕輕傾斜西林瓶，觀察是否有凝固現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 h后，對(duì)照組已完全凝固，1 MIC的安石榴苷處理組未發(fā)生凝固，1/2 MIC，1/4 MIC處理組呈半凝固狀態(tài)，而1/8 MIC和1/16 MIC處理組則完全凝固。連續(xù)觀察至6 h，仍為上述結(jié)果?？梢?jiàn)，安石榴苷能夠以劑量依賴的形式抑制金黃色葡萄球菌凝固酶的表達(dá)。血漿凝固酶是一種侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬[22]。安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達(dá)，從而降低金黃色葡萄球菌的侵襲力。

2.4 安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌總腸毒素表達(dá)的影響

*表示與對(duì)照組相比，具有顯著差異；**表示與對(duì)照組相比，具有極顯著差異

圖2 安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素表達(dá)的影響

Figure 2 Effect of punicalagin on the expression ofS.aureusenterotoxins

2.5 安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)的影響

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)后，可見(jiàn)凝膠中均為單一條帶，未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶(圖3)，說(shuō)明每對(duì)引物的特異性良好，可用于后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)。由圖4可知，每個(gè)基因的溶解曲線均為單個(gè)峰，再次說(shuō)明4個(gè)基因的引物的特異性較強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

自左向右依次為100 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、sea、hla、agrA、16S rRNA

圖3 待測(cè)基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 3 Agarose gel electrophoresis result of PCR products from genes to be tested

圖4 qRT-PCR溶解曲線Figure 4 qRT-PCR dissociation curves

由圖5可知，當(dāng)安石榴苷的濃度為1/8 MIC時(shí)，所檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的下降，腸毒素基因sea和溶血素基因hla的相對(duì)表達(dá)水平分別是對(duì)照組的3%，5%，調(diào)節(jié)基因agrA的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的5%，且均與對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)；在1/16 MIC濃度下，hla的表達(dá)量為對(duì)照組的68%，差異極顯著，sea與agrA的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。安石榴苷對(duì)腸毒素表達(dá)的抑制作用在mRNA水平與蛋白水平上無(wú)很好的相關(guān)性，可能是由于mRNA水平代表的是上游轉(zhuǎn)錄因子的激活，而轉(zhuǎn)錄后的修飾、翻譯等一系列過(guò)程對(duì)腸毒素的表達(dá)量也有直接影響。金黃色葡萄球菌在對(duì)數(shù)中后期合成的細(xì)胞膜表面蛋白和胞外蛋白受到由多個(gè)元件組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，本研究中，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)到安石榴苷對(duì)agrA的轉(zhuǎn)錄有抑制作用，故安石榴苷降低毒力因子的表達(dá)部分依賴于agr二元調(diào)控系統(tǒng)。

**表示與對(duì)照組相比，具有極顯著差異

3 結(jié)論

安石榴苷以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，且對(duì)溶血素、血漿凝固酶和腸毒素的表達(dá)發(fā)揮明顯的抑制作用。安石榴苷能夠顯著減少α-溶血素的產(chǎn)生，但對(duì)溶血素的抑制作用未呈現(xiàn)濃度依賴性；在高于1/4 MIC 濃度下安石榴苷能夠降低血漿凝固酶的表達(dá)，使血漿未發(fā)生明顯凝固；通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測(cè)到在高于1/2 MIC濃度下，安石榴苷能顯著降低總腸毒素的產(chǎn)生量；安石榴苷能顯著抑制腸毒素基因sea、溶血素基因hla和調(diào)節(jié)基因agrA的轉(zhuǎn)錄。然而，安石榴苷在食品介質(zhì)中的抑菌和抗毒力因子表達(dá)的效果尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。