張蕾琛，孫楠，王迎兒，應(yīng)泉盛，嚴(yán)蕾艷，黃蕓萍，王毓洪，王潔

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波市瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315040)

培育單倍體植株在遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究和植物育種中具有重要意義。1922年，意大利的植物學(xué)家Blakeslee首次在曼陀羅中發(fā)現(xiàn)了自然產(chǎn)生的單倍體植株[1]，引起了植物學(xué)家和育種家的廣泛關(guān)注。隨后，植物學(xué)家開始了離體誘導(dǎo)單倍體植株再生的研究。離體雌核發(fā)育是指通過離體培養(yǎng)未受精子房或胚珠，使子房中大孢子或雌配子體向孢子體途徑轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生單倍體或雙單倍體植株的過程[2]。相對(duì)于離體雄核發(fā)育，離體雌核發(fā)育的研究歷史較短，且由于植物本身生理因素和技術(shù)等方面的原因，利用離體雌核培養(yǎng)獲得單倍體植株的技術(shù)體系并不完善和成功。但離體雌核發(fā)育具有其獨(dú)特的價(jià)值，尤其在雄核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體尚未成功或誘導(dǎo)率太低，白化苗率高，雄性不育植株及雌雄異株等植物中，離體雌核發(fā)育是獲得優(yōu)良單倍體植株的唯一可行途徑[3-4]。此外，在某些材料的離體雄核培養(yǎng)中，植株表現(xiàn)明顯的性狀變異和倍性變異，而離體雌核培養(yǎng)的后代則較為穩(wěn)定。因此，離體雌核發(fā)育作為離體雄核發(fā)育的補(bǔ)充，為單倍體誘導(dǎo)提供了另外一條有效的途徑[5]。

葫蘆科植物的離體雄核培養(yǎng)難度極大且成功率很低，因此，離體雌核培養(yǎng)技術(shù)已成為獲得葫蘆科植物單倍體的重要途徑[6]。南瓜(Cucurbitamoschata)是葫蘆科重要的蔬菜作物之一，擁有“世界性蔬菜”的美稱，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健功能[7]，獲得雙單倍體純系植株對(duì)于加快南瓜育種進(jìn)程具有重要意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)葫蘆科植物離體雌核培養(yǎng)的研究已有報(bào)道[8-11]，但鮮見在南瓜中報(bào)道，且受基因型影響較大[12-13]。本研究以11個(gè)砧木型南瓜一代雜交品種的未授粉子房或胚珠為外植體，對(duì)影響南瓜未授粉子房或胚珠離體誘導(dǎo)胚狀體的主要因素進(jìn)行了探索，為完善南瓜離體雌核培養(yǎng)技術(shù)體系及育種應(yīng)用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料均由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供的11份砧木型南瓜一代雜交品種，其中包括2份西葫蘆雜交材料(X1、X2)、5份中國(guó)南瓜雜交材料(Z1、Z2、Z3、Z4和Z5)、3份印度南瓜雜交材料(Y1、Y2和Y3)和1份印中雜交南瓜材料Y4。于2017—2018年3月中旬育苗，4月下旬定植于寧波高新農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗(yàn)園區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 外植體取樣

在開花前1 d進(jìn)行扎花，以確保未授粉。取開花當(dāng)天的未授粉子房作為外植體，盡量選取自生長(zhǎng)健壯的植株。

1.2.2 外植體處理與消毒

用無菌水清洗外植體表面，用解剖刀除去花瓣和柱頭部分。

對(duì)11份南瓜材料的外植體進(jìn)行以下操作：削去表皮，將子房縱切成4塊，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗1次，用3% NaClO消毒8 min，用無菌水沖洗6次，用解剖刀削去子房壁組織，用接種針剝離出胚珠，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

對(duì)南瓜材料X1的外植體進(jìn)行如下3種操作：1)削去表皮，將子房橫切成1～2 mm厚的切片，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗1次，用3% NaClO消毒8 min，用無菌水沖洗6次，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。2)削去表皮，將子房縱切成1～2 mm厚的切片，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗1次，用3% NaClO消毒8 min，用無菌水沖洗6次，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。3)削去表皮，將子房縱切成4塊，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗1次，用3% NaClO消毒8 min，用無菌水沖洗6次，用解剖刀削去子房壁組織，用接種針剝離出胚珠，將其接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基用IM-4，接種后的外植體在35 ℃黑暗下熱激5 d后，置于光照(3 500 lx)16 h、25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)觀察其外植體處理方式對(duì)誘導(dǎo)胚珠膨大、轉(zhuǎn)綠的影響。

1.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基及影響因子

誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以Murashige and Skoog(1962)作為基本培養(yǎng)基，包括大量元素、微量元素和維他命。

8組誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的激素，具體為IM-1(5.00 mg·L-12,4-D)、IM-2(4.00 mg·L-12,4-D+1.00 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA)、IM-3(4.00 mg·L-12,4-D+1.00 mg·L-16-BA+0.25 mg·L-1NAA)、IM-4(4.00 mg·L-12,4-D+0.50 mg·L-16-BA+0.50 mg·L-1NAA)、IM-5(1.00 mg·L-12,4-D)、IM-6(1.00 mg·L-12,4-D+1.00 mg·L-1KT)、IM-7(1.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA)和IM-8(0.04 mg·L-1TDZ)。

所有培養(yǎng)基中均添加3%的蔗糖和0.8%的瓊脂，pH調(diào)至5.7～5.8，在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.4 胚狀體的獲得

接種后的外植體在35 ℃黑暗下熱激5 d后，置于光照(3 500 lx)16 h、25 ℃培養(yǎng)箱中6周，之后在無添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察胚狀體的形成。

南瓜材料X1，剝?nèi)∨咧楹蠼臃N在IM-4誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。對(duì)外植體分別進(jìn)行0、3、5和7 d不同時(shí)間長(zhǎng)度的35 ℃黑暗下熱激處理，再置于光照(3 500 lx)16 h、25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察不同條件下胚珠膨大和轉(zhuǎn)綠的比率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

熱激完成后記錄膨大的胚珠數(shù)目，25 ℃光下培養(yǎng)7 d后記錄胚珠轉(zhuǎn)綠數(shù)；培養(yǎng)6周后，記錄胚狀體個(gè)數(shù)。計(jì)算胚珠膨大率、胚珠轉(zhuǎn)綠率、胚狀體誘導(dǎo)率和成苗率。利用SPSS軟件對(duì)以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

不同基因型供體材料在相同誘導(dǎo)條件下對(duì)培養(yǎng)的反應(yīng)不一致，對(duì)胚狀體誘導(dǎo)有不同程度的表現(xiàn)(表1，圖1)。不同基因型對(duì)誘導(dǎo)胚珠膨大(P=0.003)、胚珠轉(zhuǎn)綠率(P=0.001)和胚狀體誘導(dǎo)率(P=0.001)有顯著影響。其中，胚狀體誘導(dǎo)率最高的是西葫蘆組合X1(6.9%)，其次是中國(guó)南瓜組合Z1(3.8%)和西葫蘆組合X2(3.7%)。胚珠膨大率最高的是印度南瓜組合Y2(90.5%)，但其胚珠轉(zhuǎn)綠率和胚狀體誘導(dǎo)率都不高。中國(guó)南瓜組合Z3、Z4、Z5和印度南瓜組合Y1、Y3，以及印中雜交組合Y4雖然都有一定程度的胚珠膨大和轉(zhuǎn)綠，但卻未誘導(dǎo)出胚狀體。從不同南瓜類型看，西葫蘆總體比中國(guó)南瓜和印度南瓜更易誘導(dǎo)出胚狀體。

表1 不同基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(表2～5同)。

2.2 不同濃度激素處理對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

不同激素對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)結(jié)果見表2。不同培養(yǎng)基對(duì)胚珠膨大率的影響不顯著(P=0.129)，但對(duì)胚珠轉(zhuǎn)綠率(P<0.001)和胚狀體誘導(dǎo)率(P=0.001)影響顯著。其中，培養(yǎng)基IM-3胚狀體誘導(dǎo)率最高(4.8%)；培養(yǎng)基IM-8胚珠轉(zhuǎn)綠率和胚狀體誘導(dǎo)率都較低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，外植體在添加2,4-D的培養(yǎng)基長(zhǎng)久培養(yǎng)，轉(zhuǎn)綠的胚珠會(huì)漸漸黃化后發(fā)白。

A，從未授粉子房剝離出的胚珠；B，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠；C，誘導(dǎo)出的胚狀體；D，胚狀體初步誘導(dǎo)植株。圖1 南瓜材料Y2未受精胚珠的胚狀體誘導(dǎo)及植株再生

2.3 不同基因型和不同濃度激素互作效應(yīng)對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

不同基因型和不同濃度激素互作效應(yīng)對(duì)胚珠的膨大率(P=0.015)、胚珠轉(zhuǎn)綠率(P=0.018)和胚狀體的誘導(dǎo)率(P<0.001)都有顯著影響。由表3可知，西葫蘆材料X2培養(yǎng)基IM-4的誘導(dǎo)胚狀體效率最高(15.0%)。

表2 不同濃度激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

表3 不同基因型和不同濃度激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

2.4 外植體不同切片方式對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

本試驗(yàn)通過對(duì)南瓜材料X1外植體不同的切片方式來研究其對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響。表4表明，子房縱切法對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率顯著最低，子房橫切片和胚珠剝離對(duì)胚珠膨大轉(zhuǎn)綠及胚狀體誘導(dǎo)的差異不顯著，但在操作方法上各有利弊。子房橫切片操作相對(duì)簡(jiǎn)單，操作快，可同時(shí)處理的材料數(shù)量較多，但子房切片的厚度和子房除去胚珠的周邊組織都會(huì)影響胚狀體的誘導(dǎo)，一方面切面會(huì)誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，一方面誘導(dǎo)出的植株存在可能是胎座細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的可能性。胚珠剝離的方法較繁瑣，且材料本身的胚珠大小對(duì)離體胚珠培養(yǎng)也有一定的影響，相對(duì)小的胚珠容易在剝離的時(shí)候產(chǎn)生傷口而導(dǎo)致愈傷，有些則易發(fā)白而難以轉(zhuǎn)綠(圖2)。

表4 外植體不同切片方式對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

A，子房橫切片；B，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上膨大轉(zhuǎn)綠的胚珠；C，子房縱切片；D，從未授粉子房剝離出的胚珠。圖2 外植體不同切片處理誘導(dǎo)胚狀體

2.5 不同熱激處理時(shí)間對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

通過對(duì)南瓜材料X1外植體不同熱激處理時(shí)間來研究其對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響，表5顯示，不同熱激處理對(duì)誘導(dǎo)胚珠膨大(P<0.001)和胚珠轉(zhuǎn)綠(P=0.001)有顯著影響。相比之下，熱激處理可促進(jìn)胚珠的膨大和轉(zhuǎn)綠，其中處理5 d的胚珠膨大和轉(zhuǎn)綠的比率最高。

表5 外植體不同熱激處理時(shí)間對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

3 討論

孫守如等[12]研究表明，從南瓜未授粉子房中剝離出的胚珠在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，胚珠明顯膨大，顏色變?yōu)辄S白色。光照培養(yǎng)約18 d后，形成淺綠色且具光澤的球形胚。大約在誘導(dǎo)培養(yǎng)的20 d，球形胚發(fā)育成典型的心形胚，并逐漸與母體胚珠組織分離。將心形胚轉(zhuǎn)移至未添加任何激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行成苗培養(yǎng)，1周后轉(zhuǎn)變?yōu)樽尤~胚。

本研究統(tǒng)計(jì)不同因素影響下不同基因型南瓜品種離體雌核的胚珠膨大率、胚珠轉(zhuǎn)綠率和胚狀體誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，胚珠膨大對(duì)誘導(dǎo)胚狀體的產(chǎn)生并不產(chǎn)生直接關(guān)系，只有膨大且轉(zhuǎn)綠的胚珠才有可能誘導(dǎo)形成胚狀體。因此，胚珠膨大后進(jìn)行光照培養(yǎng)形成淺綠色球形胚的時(shí)期是誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體的關(guān)鍵時(shí)期。

影響植物未受精胚珠孤雌生殖的因素眾多。研究發(fā)現(xiàn)，未授粉子房胚狀體的誘導(dǎo)率存在明顯的基因型依賴性[14]，且胚狀體誘導(dǎo)率較高的南瓜品種均為長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)、細(xì)胞分裂較活躍、植株生理狀態(tài)較好的材料[13]。在本研究中，11個(gè)供試材料中只有5個(gè)成功誘導(dǎo)出胚狀體，其他6個(gè)材料的胚珠離體培養(yǎng)后，雖有不同程度的膨大和轉(zhuǎn)綠，但胚狀體誘導(dǎo)率均為0，說明這些基因型的品種對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的反應(yīng)較遲鈍。

大量研究表明，外源激素是影響植物未受精胚珠誘導(dǎo)出胚的決定性因素，但不同研究者使用的種類和濃度卻不完全相同。孫守如等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D、NAA和6-BA組合有利于南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)胚狀體的形成，出胚效果最好的培養(yǎng)基為MS+1.00 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1NAA+0.50 mg·L-16-BA，出胚率達(dá)31.1%。而閔子揚(yáng)等[13]的結(jié)果表明，南瓜未受精子房在MS+4.00 mg·L-12,4-D+0.50 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-16-BA和MS+0.04 mg·L-1TDZ兩種培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)胚狀體的誘導(dǎo)率均較高，分別為19.8%和20.1%。劉栓桃等[15]認(rèn)為，開花當(dāng)天的西葫蘆未受精胚珠在含5%蔗糖和0.8%瓊脂的N6基本培養(yǎng)基中添加0.50 mg·L-1NAA和1.00 mg·L-12，4-D最有利于誘導(dǎo)植株再生。程慧等[16]在MS培養(yǎng)基中添加1.00 mg·L-16-BA和0.50 mg·L-1NAA時(shí)，對(duì)西葫蘆未受精子房胚狀體的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為19.8%。本研究發(fā)現(xiàn)，在MS+4.00 mg·L-12,4-D+1.00 mg·L-16-BA+0.25 mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下出胚率最高，且不同基因型和不同濃度激素對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)存在互作效應(yīng)，西葫蘆材料X2在MS+4.00 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)胚狀體效率最高(15.0%)，這可能是因?yàn)椴煌蛐筒牧现械膬?nèi)源激素存在差異，導(dǎo)致不同基因型材料對(duì)不同激素誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生的效率也不盡相同。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用子房縱切的方法對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率較低，這可能與胎座分布有關(guān)，子房縱切使得胚珠都密集在一個(gè)剖面上，由于切片僅1～2 mm，導(dǎo)致表面胚珠易被切到而產(chǎn)生愈傷。但子房橫切片和胚珠剝離對(duì)胚珠膨大轉(zhuǎn)綠及胚狀體誘導(dǎo)不存在顯著性差異，這與孫守如等[12]的研究存在不一致。孫守如等[12]認(rèn)為，南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的出胚率(最高為32.2%)高于子房培養(yǎng)的出胚率(最高為20.6%)，這可能是因?yàn)閯冸x胚珠在試驗(yàn)操作上存在一定難度，操作不當(dāng)易使胚珠產(chǎn)生傷口而難以轉(zhuǎn)綠形成胚狀體。研究表明，在葫蘆科植物中，對(duì)外植體進(jìn)行35～40 ℃高溫預(yù)處理可提高其孤雌生殖頻率，但具體機(jī)理目前尚不清楚[12]。本研究中，35 ℃高溫預(yù)處理5 d，胚珠膨大轉(zhuǎn)綠和胚狀體誘導(dǎo)的比率最高。