徐燕爾，丁鵬輝，陳明路

(浙江農(nóng)林大學 農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 臨安 31300)

微生物污染作為生活中的常見污染問題對人類的生活產(chǎn)生了極大影響，它不但會導致食品腐敗變質喪失食用價值，而且還會引起食物中毒，危害人體健康[1]。目前防止食品微生物污染的主要途徑是使用化學防腐劑防腐，但化學防腐劑的頻繁和大量使用導致微生物耐藥性逐年增加[2]。因此，可持續(xù)發(fā)展的生物防治成為解決這一問題的有效手段。芽孢桿菌作為一種極具生防價值和開發(fā)潛力的菌種[3]，在生物防治領域占據(jù)較大的比重。

解淀粉芽孢桿菌具有較強的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力，能產(chǎn)生多種抑菌物質[4]。目前，對解淀粉芽孢桿菌的研究成果較多。邱思鑫等[4]和王德培等[5]分別從煙草莖稈和青貯玉米秸稈中分離得到內生芽孢桿菌——解淀粉芽孢桿菌TB2和對絲狀真菌具有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌BI-2。楊勝遠等[6]、朱曉飛等[7]和陳成等[8]分別從不同土壤樣品中分離出具有生物拮抗性的解淀粉芽孢桿菌K6、YB-3和對黑曲霉、稻瘟病菌等具有較強抑制作用的解淀粉芽孢桿菌HN06。權春善等[9]從堆肥中分離到1株對植物病原菌尖孢鐮刀菌具有強抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌Q-12。這些結果表明，解淀粉芽孢桿菌的提取源會影響解淀粉芽孢桿菌的作用菌種和抑菌強度。本研究從水藻樣品中篩選分離菌株，用酸沉法、硅膠柱層析得到抑菌組分，并通過特性分析抑菌組分特性。

1 材料與方法

1.1 材料

無花果和若干常見水草，小豬腸道糞便；LB固體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)液，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，PDA固體培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由浙江農(nóng)林大學本科實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離純化

取水草加一定量滅菌0.9% NaCl和滅菌石英砂，碾磨均勻。80 ℃加熱30 min，取100～200 μL涂布于LB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)1 d，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液中，200 r·min-130 ℃搖床培養(yǎng)24 h[10]。浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)東湖瀑布附近采摘的馬藻菌落標記為B1系，金魚藻的菌落標記為B2系；取自云南無花果的菌落標記為Y系；取自臨安無花果的菌落標記為L系；取自小豬腸道糞便的菌落標記為G系。

1.2.2 拮抗菌的篩選

將分離菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，取5 μL菌液至涂布了10 μL金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小[11]。

1.2.3 16S rDNA序列鑒定

以27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物，擴增16S rRNA。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，紫外燈觀察拍照。PCR產(chǎn)物回收純化并測序，將所測得的序列與GenBank(hppt://www.ncbi.nim.nih.gov)中的16S rDNA序列進行Blast分析[12]，以16S rDNA基因序列同源性>99%為鑒定標準。

1.2.4 抑菌物質的粗提

粗提物成分。依據(jù)鄒遠軍等[13]方法，將1.6 L發(fā)酵上清液8 000g離心10 min，得到上清液和下沉細胞。用1 mol·L-1HCl調節(jié)上清液pH值至2.5，4 ℃靜置12 h，然后8 000g離心上清液10 min，得到上清酸沉粗提物；下沉細胞加入20 mL甲醇超聲波處理30 min，4 ℃靜置12 h，8 000g離心10 min，旋轉蒸發(fā)上清，得到下沉細胞粗提物，并用甲醇溶解。以金黃色葡萄球菌為指示菌，分別檢測確定其抑菌活性后，比較得到抑菌效果更好的成分，保留在4 ℃冰箱貯藏備用。

1.2.5 培養(yǎng)基對抑菌效果的影響

分別取30 μL原始菌種，接種在涂布了100 μL金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。

1.2.6 培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

分別取5 μL原始菌種分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72 h。然后分別取30 μL培養(yǎng)液接種在涂布了100 μL金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。

1.2.7 擴大培養(yǎng)

根據(jù)張寶[3]的擴大培養(yǎng)方法，用酸沉法得到抑菌效果更好的成分，加入蒸餾水溶解，把pH值調回7.0后放入冷凍干燥器冷凍48 h，4 ℃冰箱貯藏備用。

1.3 解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)脂肽的純化鑒定

取一定量的提取物溶解在6 mL甲醇中，用硅膠色譜柱萃取脂肽提取物，依次以100% CHCl3，CHCl3、CH3OH體積比95∶5、90∶10、75∶25、70∶30、50∶50和100% CH3OH洗脫[14]，每次加200 mL，以金黃色葡萄球菌為指示菌，觀察各組分的抑菌效果。

1.4 解淀粉芽孢桿菌分離組分的特性研究

1.4.1 pH值對抑菌活性的影響

將分離組分按一定比例添加于pH值為2～12的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，室溫保持2 h后再將各管的pH值調至7.0，并定容至相同體積。以定容至相同體積的未處理樣品作為對照[3]，金黃色葡萄球菌為指示菌，比較pH對抑菌活性的影響。

1.4.2 溫度對抑菌活性的影響

將分離組分分別在60、80、100 ℃水浴加熱30、60、90 min。以未處理的樣品作為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，分別測定其抑菌活性，考察溫度對分離組分活性的影響。

1.4.3 蛋白酶水解對抑菌活性的影響

取一定濃度的分離組分溶液，分別加入胰蛋白酶、蛋白酶K，使酶的終濃度為1 mg·mL-1，37 ℃處理2 h，調反應液pH值為7.0。以未處理的樣品作為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，考察蛋白酶對分離組分活性的影響。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌分離純化與篩選

為研究附生于水藻的芽孢桿菌的抑菌活性，從不同水藻分離了24株芽孢桿菌，分析了其對金黃色葡萄球菌的抑制活性。根據(jù)菌種對金黃色葡萄球菌的抑制情況，篩選出8株抑菌效果較好的菌株，分別為B1-7、G-1、B1-6、B1-9、B1-6b、B2-f、B2-6、B2-5(表1)。

表1 分離菌株的抑菌效果

注：+為抑菌圈直徑>1.5 cm，++為抑菌圈直徑>2.0 cm，+++為抑菌圈直徑>2.5 cm，-為抑菌圈直徑<1.5 cm，--為抑菌圈直徑<1.0 cm。

2.2 形態(tài)學與16S rDNA序列鑒定

篩選的菌株在LB液體培養(yǎng)基中形成菌膜，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則；肉湯培養(yǎng)基中向上混濁生長，震蕩后管底沉淀生長。序列分析表明，各菌株的16S rDNA序列與GenBank中解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性>99%，表明這8株菌株均為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 抑菌效果

2.3.1 粗提物的抑菌效果

由表2可知，各菌株上清液酸沉提取物的抑菌效果差異顯著，下沉細胞提取物抑菌效果差異較小。其中，B2-6菌株的上清液酸沉提取物抑菌效果最好，所以取B2-6上清酸沉提取物進行后續(xù)試驗。

表2 B2-6菌株粗提物各成分濃度

2.3.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

由表3可知，培養(yǎng)時間對B2-6菌株抑菌活性影響不顯著，相比LB培養(yǎng)基，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基更適合培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌。因此，采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)B2-6菌株24 h，再接種于胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基進行后續(xù)試驗。

表3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對B2-6菌株抑菌效果的影響

2.4 硅膠柱層析組分的純化鑒定

以氯仿體積分數(shù)為0、100%、95%、90%、75%、70%、50%洗脫液獲得的洗脫組分中，抑菌物質濃度分別為0.125 2、0.170 2、0.299 8、0.191 3、0.131 8、0.014 9、0.004 3 mg·mL-1。由圖1可知，純甲醇洗脫的組分抑菌活性最好。因此，后續(xù)試驗取純甲醇洗脫組分進行抑菌特性分析。

圖1 B2-6菌株各洗脫組分對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

2.5 解淀粉芽孢桿菌洗脫組分的抑菌特性

2.5.1 酸堿對B2-6菌株抑菌活性的影響

pH值為2、5、7、10、12時，B2-6菌株上清酸沉提取物的純甲醇洗脫組分對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑分別為14.00、14.21、17.49、13.37、12.51 mm，表明pH值對抑菌組分的抑菌活性影響較小。

2.5.2 溫度對B2-6菌株抑菌活性的影響

由圖2可知：不同溫度處理相同時間，抑菌組分的抑菌活性差異較??；隨著處理時間的延長，抑菌組分的抑菌活性逐漸降低，但降低幅度不大。表明B2-6菌株的抑菌組分具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖2 溫度對B2-6菌株洗脫組分抑菌活性的影響

2.5.3 蛋白酶水解對B2-6菌株抑菌活性的影響

粗提物的抑菌直徑為16.2 mm，粗提物經(jīng)1 mg·mL-1胰蛋白酶和蛋白酶K水解后，抑菌直徑無明顯變化，分別為15.30、14.55 mm。表明蛋白酶對抑菌組分的抑菌活性影響較小，即抑菌組分對蛋白酶不敏感。

3 小結

從金魚藻中篩選出的解淀粉芽孢桿菌B2-6的抑菌組分熱穩(wěn)定性高，受蛋白酶影響小，pH對其抑菌活性無明顯影響，在食品防腐和植物生物防治方面有一定的應用潛力。后續(xù)研究可從分子角度對其抑菌成分進行進一步的分析鑒定，為篩選應用拮抗解淀粉芽孢桿菌等試驗提供借鑒與參考。