甘文華，黃 凱，呂紫薇，高劭妍,2，蘇程程，李霄鶴,2，周紅剛,2

(1.南開大學藥物化學生物學國家重點實驗室、南開大學藥學院和天津市分子藥物研究重點實驗室，天津 300350；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院高通量分子篩選中心，天津 300070；3. 中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心，天津 300162)

肺纖維化是一種死亡率高的肺部疾病，其特征是瘢痕形成，導致漸進性和不可逆轉的肺泡結構破壞。肺纖維化導致肺功能障礙、氣體交換困難、呼吸衰竭，最終引起死亡。特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是其中最為嚴重和最難治療的一種，IPF病因不明，確診后中位生存期僅為2-6年[1]。目前已上市的針對IPF的治療藥物有兩種：吡非尼酮(pirfenidone，PFD)和尼達尼布(nintedanib，NDN)。

PFD是一種吡啶酮化合物，2011年在歐盟被批準用于治療成人輕至中度IPF，2014年在美國被批準治療IPF[2]，同年在中國上市銷售。PFD抗肺纖維化的機制尚不完全清楚，動物實驗結果顯示，其具有抗纖維化和抗炎作用[3-4]。NDN是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，分別于2014、2015、2017年被美國FDA、歐盟EMA、中國CFDA批準用于治療IPF[5]。NDN能夠通過抑制肺纖維化相關調控因子——血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)及成纖維生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)活性，緩解肺纖維化進展[6]。

轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)是肺纖維化進展過程中重要的促纖維化細胞因子。肌成纖維細胞是肺纖維化進程中的關鍵效應細胞，可合成分泌細胞外基質(extracellular matrixc，ECM)[7-8]。TGF-β和PDGF均可作用于肺成纖維細胞，促進其增殖、遷移及產生ECM。TGF-β1可通過激活其下游Smad信號，促進組織瘢痕形成和肺纖維化發(fā)生[9]。

因前期研究并未在同一實驗體系中檢測兩個上市藥物的體外抗肺纖維化藥效，通過檢測吡非尼酮和尼達尼布對成纖維細胞增殖、遷移和活化的影響，可以更好地闡釋兩個上市藥物的機制，比較兩個上市藥物對肺纖維化關鍵指標的影響程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人胚肺成纖維細胞HFL1(ATCC)。

1.1.2藥物與試劑 吡非尼酮(大連美侖生物技術有限公司，純度>98.5%)；尼達尼布(北京華威銳科化工有限公司，純度為99%)；F12K培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(康潤生物科技有限公司)；青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Life Science)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(碧云天生物技術有限公司)；TGF-β1、PDGF(美國PeproTech公司)；TRIzol試劑、DEPC-H2O(Life Technologies 公司)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市光復科技發(fā)展有限公司)；反轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司)；qPCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、I型膠原蛋白(collagen 1，COL1)引物(泓迅生物科技有限公司)；α-SMA、FN、COL1一抗(Affinity Antibody公司)；p-Smad3抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(力康發(fā)展有限公司)；高速冷凍離心機、Multiskan Fc型酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；熒光定量PCR儀(Roche)；電泳設備(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HFL1復蘇后，接種于含有10%胎牛血清和1‰雙抗(青霉素和鏈霉素)的F12K培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據實驗前期結果，確定TGF-β1、PDGF刺激的最佳劑量分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1。實驗分組如下：對照組、TGF-β1/PDGF組、吡非尼酮組、吡非尼酮+TGF-β1/PDGF組、尼達尼布組、尼達尼布+TGF-β1/PDGF組。

1.2.2MTT法檢測HFL1增殖 收集對數期細胞(細胞密度為80%左右)，調整細胞懸液濃度，于96孔板中鋪板，密度為30%～40%,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細胞單層長至約80%，加入濃度梯度的吡非尼酮(0、0.625、1.25、2.5、5、10 mmol·L-1)或尼達尼布(0、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)。孵育24 h，每孔加入15 μL濃度為5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h后，終止培養(yǎng)，每孔加入120 μL DMSO，在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度值。

1.2.3劃痕實驗檢測HFL1遷移 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，于24孔板中鋪板，密度為50%～60%，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細胞單層長至約80%，劃痕，更換無血清培養(yǎng)基，并加入吡非尼酮(1 mmol·L-1)、尼達尼布(2 μmol·L-1)，分別在加藥后0、12、24、48 h，于同一位置拍照。

1.2.4qPCR、Western blot檢測HFL1活化 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，分別在12孔板和6孔板中鋪板，密度為50%～60%，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細胞單層長至約80%，更換0.1%血清培養(yǎng)基，饑餓處理24 h后，加入吡非尼酮(1 mmol·L-1)、尼達尼布(2 μmol·L-1)。分別提取細胞RNA和蛋白質進行qPCR和Western blot，檢測α-SMA、FN、COL1、p-Smad3的表達，分析HFL1的活化程度。引物序列：α-SMA：F：5′-CTATGAGGGCTAT GCCTTGCC-3′，R：5′-GCTCAGCAGTAGTAACGAAG GA-3′；FN：F：5′-CGGTGGCTGTCAGTCAAAG-3′，R：5′-AAACCTCGGCTTCCTCCATAA-3′；COL1：F：5′-AG GGCAACAGCAGGTTCACTTACA-3′，R：5′-AGCGGG GGAAGGAGTTAATGAAAC-3′。

2 結果

2.1 吡非尼酮、尼達尼布對HFL1增殖的影響通過MTT實驗比較吡非尼酮、尼達尼布對活化的肺成纖維細胞增殖的影響。Fig 1結果表明，吡非尼酮和尼達尼布均能抑制TGF-β1誘導的HFL1的增殖，尼達尼布作用效價高于吡非尼酮。

Fig 1 MTT results of pirfenidone(A) and nintedanib(B)

Fig 2 Scratch test results of TGF-β1 induced (A,B) and PDGF induced (C,D)

2.2 吡非尼酮、尼達尼布對HFL1遷移的影響根據MTT實驗結果，選擇吡非尼酮作用濃度為1 mmol·L-1，尼達尼布作用濃度為2 μmol·L-1。通過劃痕實驗，比較吡非尼酮、尼達尼布對活化的肺成纖維細胞遷移的影響。分別用TGF-β1、PDGF刺激HFL1，F(xiàn)ig 2結果表明，與模型組相比，吡非尼酮和尼達尼布均能抑制HFL1的遷移。TGF-β1刺激12 h時，尼達尼布與吡非尼酮效果相當，TGF-β1刺激24、48 h時，尼達尼布效果強于吡非尼酮；PDGF刺激，尼達尼布效果強于吡非尼酮。

2.3 吡非尼酮、尼達尼布對HFL1活化和ECM分泌的影響

2.3.1qPCR檢測活化標志物mRNA表達 通過檢測TGF-β1/PDGF刺激下各組細胞α-SMA、FN、COL1的表達，觀察吡非尼酮、尼達尼布對HFL1活化和ECM分泌的影響。TGF-β1/PDGF刺激下，模型組α-SMA、FN、COL1均明顯高于對照組。實驗結果表明，與模型組相比，吡非尼酮和尼達尼布均能抑制HFL1活化和ECM分泌。TGF-β1刺激下，吡非尼酮對α-SMA的抑制作用強于尼達尼布，尼達尼布對FN、COL1的抑制作用強于吡非尼酮；PDGF刺激下，吡非尼酮對α-SMA、COL1的抑制作用強于尼達尼布，對于FN的抑制，吡非尼酮和尼達尼布作用相當(Fig 3)。

2.3.2Western blot檢測活化標志物蛋白水平 在TGF-β1刺激下，模型組α-SMA、FN、COL1、p-Smad3蛋白表達量均高于對照組。結果表明，吡非尼酮和尼達尼布給藥組均能抑制活化標志物α-SMA、FN、COL1的表達，且吡非尼酮和尼達尼布能夠通過抑制Smad3的磷酸化，抑制Smad3的活化，阻斷TGF-β/Smad3信號通路的激活，達到抗肺纖維化的作用，其中，尼達尼布對Smad3磷酸化的抑制作用強于吡非尼酮(Fig 4)。

3 討論

TGF-β和PDGF廣泛參與不同器官纖維化的發(fā)展，在IPF患者中均高表達，并且能夠促進肺成纖維細胞增殖、遷移、活化[9-10]。吡非尼酮和尼達尼布能夠明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導的肺成纖維細胞的增殖，且呈明顯劑量依賴性，尼達尼布低劑量抑制作用較吡非尼酮明顯；吡非尼酮和尼達尼布能夠明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導的肺成纖維細胞的遷移，尼達尼布抑制作用強于吡非尼酮；從實際臨床用藥劑量來看，尼達尼布最大劑量300 mg·d-1，吡非尼酮最大劑量1 800 mg·d-1，由于尼達尼布效價較高，低劑量給藥即可明顯抑制TGF-β1和PDGF誘導的肺成纖維細胞的增殖和遷移。

Fig 3 qPCR results of markers under action of pirfenidone and nintedanib

Fig 4 Western blot results of various markers under action of pirfenidone and nintedanib

α-SMA陽性肺成纖維細胞在IPF患者肺部增加，并構成成纖維細胞病灶的主體部分[11]。ECM沉積是造成肺纖維化的主要原因，F(xiàn)N、COL1是ECM的主要成分，F(xiàn)N、COL1過度沉積，會導致瘢痕形成，肺功能障礙，造成呼吸衰竭，并最終導致死亡。吡非尼酮和尼達尼布明顯降低TGF-β1和PDGF誘導的α-SMA、FN、COL1A2的mRNA水平，吡非尼酮對α-SMA mRNA的抑制作用較強，尼達尼布對FN、COL1A2 mRNA的抑制作用較強；吡非尼酮和尼達尼布能夠降低TGF-β1誘導的α-SMA、FN、COL1的蛋白水平，尼達尼布對α-SMA蛋白表達的抑制作用與吡非尼酮相當，對FN、COL1蛋白表達的抑制作用強于吡非尼酮。

TGF-β被認為是組織纖維化中的關鍵調控因子，通過促進下游纖維化相關靶基因過量表達，引起組織瘢痕[12]。與用博來霉素處理的野生型小鼠相比，敲除Smad3基因的小鼠能減少I型前膠原mRNA表達，降低肺中羥脯氨酸含量，從而改善肺纖維化[13]。吡非尼酮和尼達尼布能夠抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化，吡非尼酮對Smad3磷酸化的抑制率為13%，尼達尼布對Smad3磷酸化的抑制率為51%。自噬能夠促進膠原降解，在體外，TGF-β可劑量和時間依賴性地抑制肺成纖維細胞的自噬[14]。原代IPF肺成纖維細胞中，尼達尼布能夠通過Beclin-1途徑，促進自噬改善肺纖維化[15]。尼達尼布改善肺纖維化機制之一可能是通過抑制TGF-β/Smad3信號通路促進自噬，該機制有待進一步研究。

綜上所述，吡非尼酮和尼達尼布是目前臨床上治療IPF的藥物，吡非尼酮靶點未知，但其具有抗炎作用，并且可以通過影響TGF-β通路發(fā)揮抗纖維化作用。尼達尼布是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，尼達尼布對TGF-β信號通路的抑制作用強于吡非尼酮。本研究首次在相同實驗條件下，進行體外細胞實驗，比較吡非尼酮和尼達尼布對成纖維細胞增殖、遷移、活化、ECM和TGF-β信號通路的影響，實驗結果顯示尼達尼布優(yōu)于吡非尼酮。

(致謝：本實驗主要在南開大學藥學院完成，在此對實驗室的老師及同學表示衷心的感謝！)