胡 瑩，廖云鵬，李福書，周 婭，李 沁，孫文娟，何百成

(重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶 400016)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphorgenetic protein 9，BMP9)作為BMP家族中研究較少的成員，是有效誘導間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化的因子之一[1]。因此，BMP9可能具有良好的臨床應用前景，用于治療骨質(zhì)疏松、骨缺損、骨不連接等骨相關疾病。迄今為止，BMP9誘導MSCs骨向分化的具體分子機制仍不十分清楚。

作為TGF-β家族的一員，BMP9本身參與多種生理過程，如調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元發(fā)育、鐵代謝與血管生成，以及促進MSCs向成骨細胞系定向分化[2]等。BMP9可以通過經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮其生理功能，此外，BMP9也可以通過非經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮作用，如p38 MAPK和PI3K/Akt途徑等[3]。研究報道，多種其他信號或因子能夠參與調(diào)節(jié)BMP9誘導的MSCs成骨分化，如生長激素(growth hormone，GH)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、維甲酸、Wnt/β-catenin及Notch信號[4]。BMP9雖能誘導MSCs骨向分化，但同時也伴有成脂分化[5]。因此，降低BMP9誘導MSCs的成脂分化可能是增強其誘導MSCs成骨分化的有效措施之一。

Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)細胞增殖分化的重要信號之一[6]。據(jù)報道，BMP9在誘導MSCs成骨分化的過程中能增強Wnt/β-catenin信號的活性，沉默β-catenin則減弱BMP9誘導MSCs成骨分化的能力[7]。但BMP9在誘導MSCs成骨分化過程中調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號的機制尚不清楚。Wnt10b是Wnt/β-catenin信號的一種配體，對前脂肪細胞的分化有抑制作用，但能促進成骨分化[8]。因此，Wnt10b可能對BMP9誘導的MSCs成骨分化具有促進作用，盡管兩者的關系目前還不清楚。本研究在前期工作基礎上，分析Wnt10b在BMP9誘導MSCs成骨分化中的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 實驗所用NIH孕鼠(E12.5)，購自于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，并代養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)。

1.1.2細胞及細胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，從NIH小鼠12.5 d胚胎中提取獲得；人腎上皮細胞HEK293、間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2、成肌細胞C2C12及小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1，購自ATCC(Manassas，VA，USA)。采用高糖DMEM(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1鏈霉素)進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2及37 ℃。

1.1.3試劑 一抗Wnt10b(ab155332)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)(ab15191)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)(ab32096)，購自Abcam公司；一抗GAPDH(sc-32233)、骨橋素(osteopontin，OPN)(sc-10593)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)(sc-18319)、重組人CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)(sc-61)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)(sc-1984)、Smad1/5/8(sc-6031-R)、p-Smad1/5/8(sc-12353)，購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.4儀器 細胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(Thermo公司)；超凈操作臺(安泰技術有限公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)；濕式轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳槽(六一儀器廠)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 重組腺病毒的構建及轉(zhuǎn)染本實驗所用重組腺病毒采用Ad-Easy系統(tǒng)進行構建[9]。利用PCR擴增BMP9、Wnt10b、綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列，將所獲片段以及Wnt10b的小干擾RNA片段克隆到腺病毒穿梭載體中，然后將穿梭質(zhì)粒與AdEasy-1在BJ5183細菌中重組。最后，將重組好的質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化到HEK293細胞中包裝重組腺病毒。所獲重組腺病毒載體分別命名為AdBMP9、AdWnt10b、AdGFP、AdsiWnt10b[10]，其中，GFP用于標記腺病毒載體，AdGFP作為載體對照。

1.3 流式細胞術周期分析將C3H10T1/2細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗設計要求，分別用不同的重組腺病毒(AdGFP、AdBMP9、AdWnt10b及AdBMP9合并AdWnt10b)處理細胞。48 h后收集細胞，用冰PBS(4 ℃)重懸細胞并離心(800 r·min-1, 5 min×2次)。然后用預冷的70%、50%、30%乙醇固定，并用PBS洗滌。加入1 mL PI(20 g·L-1)溶液(含RNase，1 g·L-1)孵育30 min。最后用流式細胞儀進行周期分析。每組實驗重復3次。

1.4 Real-time PCR實驗利用TRIzol試劑裂解細胞并提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA。將所得cDNA稀釋5～10倍，作為模板用于定量PCR檢測。以GAPDH的表達水平對目的基因的表達進行標準化。本實驗所涉及到引物序列見Tab 1。

1.5 Western blot實驗將細胞接種于6孔板中，根據(jù)實驗設計利用重組腺病毒以及其他試劑處理。在預定的時間點，裂解細胞，并將裂解液煮沸10 min使裂解物變性。所得樣品在SDS-PAGE膠中分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以10%脫脂奶粉封閉，以相應的一抗和二抗分別孵育。最后利用超敏ECL化學發(fā)光試劑測定靶蛋白表達情況。每組實驗重復3次。

Tab 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.6 礦物質(zhì)沉積實驗將細胞接種于24孔板中，并根據(jù)實驗設計用相應重組腺病毒及其他試劑處理。21 d后，棄培養(yǎng)基并用PBS洗滌3次，室溫下加入0.05%戊二醛固定10 min，用蒸餾水洗滌。然后以0.4%茜素紅S溶液對細胞進行染色5 min，用蒸餾水輕輕洗滌。觀察礦物質(zhì)沉淀。掃描平板，并在顯微鏡下采集圖像。每組實驗重復3次。

1.7 油紅O染色將細胞接種到24孔板中，根據(jù)實驗設計用重組腺病毒及其他相應試劑處理細胞。14 d后，先用10%福爾馬林固定細胞30 min，然后棄固定液并用PBS洗滌3次，最后用油紅O溶液染色，在顯微鏡下采集圖像。定量分析時，用異丙醇從細胞中提取油紅O，在570 nm處測定吸光度值。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 BMP9在干細胞中對Wnt10b表達的影響Wnt10b是經(jīng)典Wnt/β-cantein信號的一種配體。課題組前期研究表明，BMP9能夠促進MSCs的成骨分化，但BMP9與Wnt10的關系尚不清楚。因此，本研究旨在探討Wnt10b是否參與調(diào)節(jié)BMP9誘導MSCs成骨分化的作用。首先檢測在MSCs中，BMP9對Wnt10b表達的影響。結果顯示，BMP9在C3H10T1/2細胞及3T3-L1細胞中能上調(diào)Wnt10b的mRNA水平(Fig 1A、1B)，并且增加C3H10T1/2細胞中Wnt10b的蛋白表達水平(Fig 1C)。此外，Wnt10b在C3H10T1/2、C2C12、MEFs和MC3T3-E1等細胞中均有表達(Fig 1D)。以上結果提示，Wnt10b可能在BMP9誘導MSCs成骨分化過程中起重要調(diào)節(jié)作用。

2.2 Wnt10b對BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的影響B(tài)MP9可在C3H10T1/2細胞中上調(diào)Wnt10b表達。因此，本研究接下來分析Wnt10b是否可以增強BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的能力。定量PCR檢測結果顯示，BMP9能夠上調(diào)Dlx-5 mRNA的表達水平，Wnt10b也能增加Dlx-5 mRNA的表達水平，并明顯增強BMP9上調(diào)Dlx-5表達的能力(Fig 2A)。Western blot結果顯示，BMP9增加C3H10T1/2細胞中OPN和OCN的蛋白水平，Wnt10b對OPN和OCN的蛋白水平?jīng)]有明顯影響，但能明顯增強BMP9對OPN和OCN表達的促進作用(Fig 2B)。同時，Wnt10b還能明顯增強BMP9誘導MSCs礦物質(zhì)沉積的能力(Fig 2C)。沉默Wnt10b不僅降低Dlx-5 mRNA水平，也減弱BMP9上調(diào)Dlx-5表達的能力(Fig 2D)，沉默Wnt10b也減弱BMP9上調(diào)OPN和OCN蛋白水平的作用(Fig 2E)。礦化實驗結果也顯示，沉默Wnt10b能減弱BMP9在C3H10T1/2細胞中礦化的能力(Fig 2F)。以上結果提示，Wnt10b可能是促進BMP9誘導MSCs成骨分化的重要調(diào)節(jié)因子。

2.3 BMP9及Wnt10b對C3H10T1/2細胞增殖的影響為分析Wnt10b促進BMP9誘導干細胞骨向分化的機制，本研究分析了Wnt10b與BMP9對細胞周期的影響。流式分析結果顯示，BMP9及Wnt10b均不影響細胞的周期(Fig 3A)。 Western blot分析也顯示，BMP9及Wnt10b均不明顯影響PCNA的蛋白水平(Fig 3B)。以上結果提示，Wnt10b促進BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化可能與影響增殖能力無關。

Fig 1 Effect of BMP9 on expression of Wnt10b in stem cells

Fig 2 Effect of Wnt10b on BMP9-induced osteogenic markers in C3H10T1/2 cells

Fig 3 Effect of BMP9 and Wnt10b on cell cycle in C3H10T1/2 cells

2.4 Wnt10b對BMP9介導的BMP/Smad信號轉(zhuǎn)導的影響B(tài)MP9可通過經(jīng)典BMP/Smad途徑或非經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮其生理功能。因此，本研究進一步檢測Wnt10b促進BMP9誘導干細胞成骨分化，是否與影響B(tài)MP/Smad信號的活性有關。Western blot結果顯示，BMP9對Smad1/5/8水平無明顯影響，但能明顯增加Smad1/5/8的磷酸化水平。Wnt10b對p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平無明顯影響，但能明顯增強BMP9對Smad1/5/8磷酸化的促進作用(Fig 4A、4B)。沉默Wnt10b對p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平也無明顯影響，但能明顯降低BMP9對Smad1/5/8磷酸化的促進作用(Fig 4C、4D)。以上結果提示，Wnt10b促進BMP9誘導干細胞成骨分化的作用可能與增強BMP/Smad信號的轉(zhuǎn)導活性有關。

2.5 Wnt10b對BMP9誘導C3H10T1/2細胞成脂分化的影響干細胞的成骨分化和成脂分化是兩個相互影響的生理過程，脂肪生成增加可能導致骨形成減少。據(jù)報道，Wnt10b可以抑制前脂肪細胞分化。因此，我們推測Wnt10b也可能通過抑制BMP9介導的MSCs成脂分化，從而增強BMP9的成骨分化誘導能力。油紅O染色結果顯示，Wnt10b明顯降低BMP9誘導C3H10T1/2細胞成脂分化的能力(Fig 5A、5B)。Western blot結果顯示，BMP9上調(diào)C/EBPα和PPARγ的蛋白水平，但Wnt10b能明顯減弱BMP9增加C/EBPα和PPARγ水平的作用(Fig 5C)。沉默Wnt10b能促進干細胞向脂肪細胞分化，同時明顯增強BMP9誘導的脂滴形成(Fig 5D、5E)，并且增強BMP9上調(diào)C/EBPα和PPARγ蛋白水平的能力(Fig 5F)。以上結果提示，Wnt10b對BMP9誘導干細胞成骨分化的作用可能部分與抑制BMP9誘導干細胞成脂分化有關，但具體機制有待進一步深入研究。

Fig 4 Effect of Wnt10b on BMP9-induced BMP/Smad signaling n=3)

Fig 5 Effect of Wnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells

3 討論

本研究分析了Wnt10b對BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的影響，以及調(diào)節(jié)該過程的可能分子機制，首次提出Wnt10b增強BMP9誘導成骨分化的能力可能與增強BMP/Smad信號的轉(zhuǎn)導活性有關，并且進一步探索了其對BMP9成脂誘導分化能力的影響，為進一步揭示W(wǎng)nt信號通路與BMP/Smad通路之間的關系提供實驗基礎。結果發(fā)現(xiàn)，BMP9能上調(diào)Wnt10b的表達，Wnt10b能明顯促進BMP9誘導C3H10T1/2細胞成骨分化的能力；Wnt10b的這種作用可能與增強BMP/Smad信號的傳導，同時抑制BMP9誘導干細胞的成脂分化有關。

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員，是調(diào)節(jié)細胞多種重要生理過程的關鍵因子，如細胞的增殖和分化[4]。雖然BMP9(也稱為GDF2)最開始是從小鼠肝臟的cDNA文庫中鑒定，但其具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育、鐵代謝、血管生成，以及促使MSCs向成骨細胞系的定向分化等[1-2]。據(jù)報道，BMP9的成骨分化誘導能力可能強于BMP2和BMP7。因此，BMP9可能是最有效的誘導干細胞成骨分化的BMPs因子之一[1]。BMP9通常通過BMP/Smad途徑(即經(jīng)典BMP/Smad途徑)或非經(jīng)典BMP/Smad途徑(如p38 MAPKs和PI3K/Akt途徑)發(fā)揮其生理功能[3]。在經(jīng)典的BMP/Smad途徑中，BMP9與其膜受體結合，并激活Smad1/5/8(即p-Smad1/5/8)。然后，p-Smad1/5/8募集并磷酸化Smad4以形成復合物。最后，復合物易位到細胞核中，調(diào)節(jié)下游靶基因表達。此外，有研究表明，多種其他因子或信號也參與調(diào)節(jié)BMP9誘導的干細胞成骨分化，如GH、IGF、維甲酸和Wnt/β-catenin信號[3-4]。但BMP9誘導干細胞成骨分化的具體分子機制尚不十分清楚。

成骨和成脂分化是兩個相互影響的過程[11]。MSCs通常以成脂分化的減少為代價，向成骨細胞譜系分化，反之亦然。盡管BMP9在MSCs中顯示出強大的誘導成骨分化的能力，但它也可誘導干細胞向脂肪細胞分化[12]。因此，可以通過減弱MSCs中的成脂分化，來增強BMP9的促成骨能力。Wnt/β-catenin是調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和存活的重要信號。研究表明，Wnt信號對骨骼系統(tǒng)和脂肪的形成也非常重要[13]。異常的Wnt/β-catenin信號與多種骨相關疾病有關，如骨質(zhì)疏松癥、骨關節(jié)炎、骨硬化癥等。據(jù)報道，BMP9在誘導MSCs成骨分化時可激活Wnt/β-catenin信號，沉默β-catenin或過表達DKK1均能降低BMP9的促成骨潛能，而過表達β-catenin則增強BMP9的促成骨能力[14]。因此，BMP9誘導干細胞成骨分化作用與Wnt/β-catenin信號關系密切。

Wnt10b是Wnt/β-catenin信號的另一種經(jīng)典蛋白質(zhì)。有研究表明，Wnt10b與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關[15]。此外，Wnt10b可以促進成骨分化，并抑制前脂肪細胞的分化。因此，課題組推測，Wnt10b可能參與調(diào)節(jié)BMP9誘導的成骨分化。本研究結果顯示，BMP9可以上調(diào)C3H10T1/2細胞和其他幾種干細胞中Wnt10b的表達；Wnt10b能增加BMP9誘導的MSCs成骨指標水平，但沉默Wnt10b則降低BMP9的這種作用。提示W(wǎng)nt10b對BMP9誘導MSCs的成骨分化具有重要促進作用。研究進一步發(fā)現(xiàn)，Wnt10b明顯增加由BMP9介導的Smad1/5/8磷酸化水平，而沉默Wnt10b減弱BMP9對p-Smad1/5/8的促進作用。同時，Wnt10b可降低BMP9在C3H10T1/2細胞中上調(diào)PPARγ和C/EBPα水平的作用，并減少細胞中脂滴的形成；沉默Wnt10b增強BMP9在C3H10T1/2細胞中誘導的脂肪分化。

綜上所述，本研究的結果表明，Wnt10b可以促進BMP9誘導MSCs的成骨分化，這種作用可能與增強BMP/Smad信號的傳導活性，以及抑制BMP9誘導MSCs成脂分化有關。

[致謝：本研究在重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，感謝何通川教授(T. C. HE，芝加哥大學醫(yī)學中心)為本實驗饋贈所需的重組腺病毒載體。]