肖 飛,于婷婷

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇是一種中樞神經(jīng)功能失常性疾病，多由局部或全腦神經(jīng)元異常放電所導(dǎo)致。本病發(fā)作時(shí)常常伴隨著短暫的感覺、運(yùn)動(dòng)、意識(shí)及自主神經(jīng)功能異常，且腦電圖往往伴有癲癇波的發(fā)放。大量報(bào)道證實(shí)[1]，作為傳統(tǒng)名貴中藥天麻主要的藥物活性成分，天麻素(對(duì)羥基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)具有抗癲癇的作用，但其具體抗癲癇機(jī)制目前尚未能明確。本研究擬通過PTZ點(diǎn)燃大鼠癲癇模型，注射天麻素溶液于百會(huì)及大椎穴，觀察經(jīng)治療后癲癇大鼠行為學(xué)、腦電變化及電鏡下CA3區(qū)線粒體半定量評(píng)分，以進(jìn)一步說明天麻素穴注抗癲癇、改善認(rèn)知及腦保護(hù)的作用機(jī)理，為臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量250～325 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠標(biāo)記編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、穴注組及西藥組，每組30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及配置方法

天麻素(規(guī)格為0.2 g/支，昆明制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)：H20013046)于150 mL 0.9%氯化鈉溶液中充分溶解，溶液濃度為2 mg/mL，成人用量為0.088 6 mL/kg，換算成等效劑量0.37 mL/kg；丙戊酸鈉片(規(guī)格為0.2 g/片，山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)：H19983059)充分溶解于羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn))，配成混懸灌胃液，質(zhì)量濃度為20 mg/mL，4℃遮光保存。PTZ：購自美國(guó)Sigma公司(Sigma-P6500)，于每次實(shí)驗(yàn)前30 min，取300 mg PTZ晶體，放入150 mL 0.9%氯化鈉溶液中充分溶解，配置PTZ溶液的質(zhì)量濃度為2 mg/mL。10%水合氯醛溶液：購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 造模方法

每日上午8：30—11：30進(jìn)行給藥，予PTZ溶液35 mg/kg，造模周期為28天。每次注射后，觀察1 h大鼠的行為變化，而后進(jìn)行癇性發(fā)作評(píng)價(jià)，根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]對(duì)大鼠的癇性發(fā)作情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄每只大鼠的癇性發(fā)作等級(jí)，對(duì)可能發(fā)生的意外情況進(jìn)行干預(yù)，如出現(xiàn)3 min及以上的V級(jí)發(fā)作時(shí)，立即以10%水合氯醛腹腔注射以終止其癇性發(fā)作，防止死亡。造模周期內(nèi)，連續(xù)5天出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上的癇性發(fā)作，視為造模成功。

1.4 各組處置方法

空白組在造模周期內(nèi)予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL，連續(xù)28天；模型組按上述造模方法給予處置；穴注組在造模成功后，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]及華興邦制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圖譜》[4]提供的方法，定位大鼠百會(huì)及大椎穴，做好標(biāo)記，以0.37 mL/kg天麻素溶液分別進(jìn)行穴位注射，隔日1次，連續(xù)28天;西藥組在造模成功后，連續(xù)28天給予丙戊酸鈉溶液(350 mg/kg)灌胃，日1次。

1.5 取材

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg以對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，起效后，固定大鼠，開胸，灌注，斷頭，迅速分離海馬及腦組織，將1 mm3大小組織塊置于2.5%戊二醛固定液中前固定，4℃保存2 h以上，用于制作大鼠海馬CA3區(qū)線粒體透射電鏡標(biāo)本。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

造模成功率：造模成功后，在開始治療之前記錄各組大鼠死亡數(shù)量及原因，計(jì)算造模成功率。

腦電圖變化：末次治療結(jié)束后，每組隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行視頻腦電監(jiān)測(cè)。用10%的水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，起效后將大鼠固定于腦立體定位儀上暴露顱骨，根據(jù)Paxinos&Waston腦圖譜[5]，于大鼠背側(cè)海馬區(qū)安裝直徑小于1 mm的雙極性鋼電極1個(gè)，在顱骨上安裝不銹鋼皮質(zhì)電極3個(gè)，植入2個(gè)電極于額皮質(zhì)內(nèi)，左右各1，參考電極放于小腦，并以牙托粉及牙科水泥固定[6]。待大鼠完全清醒后記錄各組腦電圖1 h，記錄各組腦電圖形，并分析其癲癇自發(fā)性發(fā)作的頻率與腦電波幅。(參與腦電記錄的大鼠不再參與水迷宮實(shí)驗(yàn)。)

水迷宮實(shí)驗(yàn)：末次治療結(jié)束后，每組在剩余大鼠內(nèi)再隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。先將大鼠逐一放入水池，任其自由游泳以熟悉水迷宮內(nèi)環(huán)境，時(shí)長(zhǎng)為2 min；治療結(jié)束后第1～2天為定位航向訓(xùn)練，在任一象限將大鼠頭朝池壁放入水中，記錄其找到水下平臺(tái)的時(shí)間，若下水120 s以后還未找到平臺(tái)，則人為引導(dǎo)并停留10 s在平臺(tái)上，訓(xùn)練連續(xù)兩天，上午下午各1次，記錄最后1天大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(潛伏期)；第3天為空間探索試驗(yàn)，撤除平臺(tái)后，從同一入水點(diǎn)將大鼠放入水池，計(jì)時(shí)120 s，記錄各組Wistar大鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)。

電鏡下線粒體半定量分級(jí)：制作大鼠海馬CA3區(qū)線粒體透射電鏡標(biāo)本，將標(biāo)本置于 JEM-1200型投射電子顯微鏡下拍照，并參照Kloner[7]線粒體半定量分級(jí)記分方法，每個(gè)電鏡標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)視野，再從每個(gè)視野中隨機(jī)選擇10個(gè)線粒體，觀察計(jì)算每級(jí)所占百分比。Kloner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：超微結(jié)構(gòu)正常；1級(jí)：線粒體腫脹，可見嵴的分隔、基質(zhì)密度降低；2級(jí)：線粒體腫脹較1級(jí)更明顯；3級(jí)：線粒體腫脹并伴有結(jié)構(gòu)破壞；4級(jí)：3級(jí)的表現(xiàn)伴有線粒體內(nèi)外膜崩解。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)。若方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后再重復(fù)以上分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功率

除去空白組30只大鼠，本次實(shí)驗(yàn)共對(duì)90只大鼠進(jìn)行腹腔注射PTZ造模，在造模過程中，模型組因癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間過長(zhǎng)、程度過重、搶救不及時(shí)死亡3只；穴注組因腹腔注射后感染死亡1只，3只因未達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)而棄用；西藥組3只未達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)故棄用；實(shí)驗(yàn)共計(jì)點(diǎn)燃80只，點(diǎn)燃成功率為88%。

2.2 腦電圖檢測(cè)結(jié)果

各組腦電圖如圖1，空白組大鼠腦電圖表現(xiàn)為正常波形，癲癇組腦電表現(xiàn)出陣發(fā)性癇性放電，治療后穴注組與西藥組癲癇波較模型組明顯減少。模型組與空白組數(shù)據(jù)有明顯差異(P<0.01)，模型組腦電波幅顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穴注組及西藥組腦電波幅顯著降低(P<0.01)，癲癇發(fā)作頻率明顯減少；穴注組與西藥組比較無差異(P>0.05)。見表1。

注：腦電電極從上到下依次為左額葉、右額葉、左海馬、右海馬。圖1 各組腦電圖

表1 各組腦電圖檢測(cè)結(jié)果比較

注：與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與西藥組比較，3)P>0.05。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組與空白組數(shù)據(jù)有明顯差異(P<0.01)，模型組大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索試驗(yàn)中模型組的穿越平臺(tái)數(shù)明顯少于空白組；與模型組比較，穴注組及西藥組潛伏期時(shí)間及穿越平臺(tái)數(shù)均有顯著差異(P<0.01)，潛伏期時(shí)間均較模型組明顯縮短，穿越平臺(tái)數(shù)均明顯增多；穴注組與西藥組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組大鼠平均潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)的比較

注：與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01；與穴注組比較，3)P>0.05。

2.4 電鏡下海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷程度

電鏡下各組海馬區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)如圖2所示，空白組海馬神經(jīng)元的線粒體超微結(jié)構(gòu)無損傷，而模型組、穴注組及西藥組的線粒體則均有不同程度的損傷。海馬CA3區(qū)線粒體半定量損傷評(píng)分結(jié)果顯示，與模型組比較，穴注組及西藥組均有顯著差異(P<0.05)，且損傷程度均較模型組有所減輕。而穴注組與西藥組比較則無差異(P>0.05)。見表3。

圖2 電鏡下各組海馬區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)

組別n損傷程度評(píng)分(%)0級(jí)1級(jí)2級(jí)3級(jí)4級(jí)空白組301000000模型組27001.72±0.191.95±0.3196.33±0.56 穴注組2600049.88±1.0850.12±0.52?西藥組270026.34±0.5949.68±0.3123.98±0.29?

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

癲癇為大腦功能失調(diào)性疾病，以大腦局部病灶突發(fā)性的異常高頻放電并向周圍組織擴(kuò)散為特征，本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到神經(jīng)元電生理活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)。作為原發(fā)性癲癇的理想模型，PTZ可較好地模擬人類癲癇自發(fā)、反復(fù)及長(zhǎng)期發(fā)作的特點(diǎn)[8]。

中醫(yī)用天麻來治療癲癇歷史悠久，《本草綱目》記載天麻“主風(fēng)濕痹，四肢拘攣，小兒風(fēng)癇驚氣”?，F(xiàn)代藥理研究也表明，天麻具有鎮(zhèn)靜安眠、中樞抑制、抗炎、清除自由基、抗凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化應(yīng)激等作用。在研究天麻素對(duì)PTZ致癇大鼠的腦保護(hù)作用中，穆朝娟等[9]發(fā)現(xiàn)，天麻素能減輕模型大鼠由癲癇導(dǎo)致的腦損傷，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷。

中醫(yī)學(xué)經(jīng)絡(luò)理論認(rèn)為，癲癇主要病機(jī)為督脈經(jīng)氣阻滯、氣血逆亂，而督脈被認(rèn)為是人體諸陽經(jīng)的總匯，有“總督諸陽”之功，為“陽脈之海”,對(duì)整個(gè)經(jīng)絡(luò)、氣血均有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)選取進(jìn)行注射的穴位均位于督脈，百會(huì)穴位居巔頂，為“三陽五會(huì)”，具有疏通督脈經(jīng)氣、振奮陽氣、醒腦開竅等功效。大椎穴是手足三陽經(jīng)與督脈的交會(huì)穴，是陽氣匯聚點(diǎn)，刺激大椎穴不僅可以調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣，更是可以調(diào)節(jié)六陽經(jīng)之經(jīng)氣，具有通督止痙、強(qiáng)壯全身陽氣的作用[10]。二穴配伍具有疏通經(jīng)絡(luò)、行血化滯、調(diào)暢氣機(jī)、通督止痙之功效。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),針刺以上兩穴能夠改善腦部血液循環(huán)，進(jìn)而治療包括癲癇病在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11-14]。

穴位注射，又稱為“水針”, 是一種針?biāo)幉⒂玫闹嗅t(yī)特色綜合治療方法，通過針灸與藥物相結(jié)合而發(fā)揮治療效果，其理論依據(jù)來源于穴位和經(jīng)絡(luò)治療作用及藥物的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)選用的藥物為天麻素，借助穴位注射這一治療手段，通過對(duì)特定腧穴進(jìn)行刺激，最終起到改善患者機(jī)體功能的作用[15-17]，進(jìn)而對(duì)癲癇起到逐步治療的作用。

研究顯示，癲癇發(fā)作可致使大腦神經(jīng)元損傷，海馬神經(jīng)元損傷又對(duì)癲癇的發(fā)生起著重要作用，因此，減少癲癇后海馬神經(jīng)元損傷是避免癲癇反復(fù)發(fā)作、逐漸加重的一個(gè)重要途徑[18-19]。具有獨(dú)特超微結(jié)構(gòu)的線粒體，其功能主要為能量轉(zhuǎn)換，對(duì)維持神經(jīng)元正常生理功能具有重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的線粒體功能障礙可以導(dǎo)致癲癇的發(fā)作，癲癇的發(fā)作也可引起線粒體的損傷[20]，因此探討如何減輕癲癇后腦損傷可以從減少線粒體神經(jīng)元損傷方向入手。

此外，本實(shí)驗(yàn)其他檢測(cè)指標(biāo)的選擇主要基于以下考量：海馬在學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的形成方面扮演著重要角色[21]，從海馬損害角度評(píng)價(jià)癲癇后認(rèn)知障礙程度的諸多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，Morris水迷宮最為適合，在檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶力方面也最為經(jīng)典[22]。眾所周知，在癲癇病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)方面，腦電具有非常重要的價(jià)值。在形態(tài)學(xué)研究中，在研究超微結(jié)構(gòu)時(shí)，通過電鏡可反映出損傷的分布和范圍，由此對(duì)損傷程度可進(jìn)行評(píng)定。

研究結(jié)果顯示，經(jīng)干預(yù)后模型組ECG波幅和頻率明顯比空白組波幅增高；而西藥組波幅和頻率、穴注組波幅和頻率明顯較模型組降低。由此可見PTZ造模可產(chǎn)生高波幅、高頻率的異常腦電圖，而丙戊酸和天麻素穴注可對(duì)腦電波起到一定的修復(fù)作用，降低癲癇大鼠的腦電波幅及頻率。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，模型組潛伏期明顯較空白組延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)數(shù)減少，證明造模后癲癇大鼠認(rèn)知已經(jīng)出現(xiàn)了障礙，記憶力減退。穴注組和西藥組與模型組比較，兩組潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，表明穴注和西藥均可對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知、記憶力有一定的改善作用。電鏡下海馬CA3區(qū)線粒體半定量損傷評(píng)分顯示，模型組損傷程度以4級(jí)居多，而穴注組和西藥組損傷程度4級(jí)、3級(jí)參半，表明兩組較模型組比較損傷程度有所減輕。且各實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可見，西藥組與穴注組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較時(shí)P>0.05，即在腦電波修復(fù)、認(rèn)知記憶改善及減緩線粒體損傷方面，穴注天麻素效果與丙戊酸相當(dāng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)、腦電及線粒體超微結(jié)構(gòu)三方面入手，最終證實(shí)天麻素穴注對(duì)癲癇大鼠的腦保護(hù)作用療效確切，為臨床抗癲癇、改善癲癇后認(rèn)知狀況提供了新思路，其機(jī)理值得進(jìn)一步探討。