陳千權，王野影

(貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴安 550025)

高種群密度環(huán)境易導致寄生和疾病發(fā)生，因此，隨著種群密度增加，個體感染疾病的概率也相應增加。在長期進化和自然選擇過程中，個體發(fā)展出能感知種群密度并能根據(jù)種群密度調整免疫反應的能力[1]。與病原體感染相似，高種群密度可提升昆蟲的預防性免疫能力。昆蟲免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細胞免疫，前者主要包括抗菌肽和酶聯(lián)反應，后者主要包括血細胞防御反應，如吞噬作用和封閉作用[2-3]。由于缺乏后天免疫系統(tǒng)，昆蟲能識別非自身抗原并能迅速放大感染信號。感染信號主要通過Toll和IMD(Immune deficiency)通路進行轉導，進而激活脂肪體中表達抗菌肽并釋放到血淋巴中。先天免疫系統(tǒng)是昆蟲對抗細菌、真菌和病毒等病原體入侵的重要防線。革蘭氏陽性菌和真菌可激活Toll信號通路而激活抗菌肽表達，而革蘭氏陰性菌主要通過激活IMD信號通路而激活抗菌肽表達[4]。果蠅中Toll-1和Toll-9過表達可誘導抗菌肽表達[5]，Toll-5和Toll-9能激活抗真菌肽(Drosomycin)的表達[6]。病毒可通過Toll-7而激活抗病毒自噬反應[6]，通過自噬抑制病毒復制[7],而Toll-8負調控呼吸道上皮抗微生物反應[8]。Toll信號通路除參與免疫信號轉導外也調控發(fā)育過程。Toll-2參與卵泡細胞及唾液腺發(fā)育[9]，Toll-7和Toll-10調控胚胎發(fā)育過程中前后軸延伸[10]，Toll-8參與胚胎時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腿發(fā)育[9]。與此相似，家蠶Toll-1和Toll-2在卵巢中高表達，二者可能在胚胎發(fā)育中具有重要作用[11]。Toll信號通路相關基因對昆蟲生存至關重要，因此，其相關基因可作為有害昆蟲管理的靶基因[12]。

四紋豆象是全球分布的重要倉儲害蟲，依賴種群密度展現(xiàn)明顯的表型可塑性，即在高種群密度條件下，個體行為更活躍、個體發(fā)育更快速、性成熟更早、產(chǎn)卵更早、產(chǎn)卵數(shù)量更少[13]。四紋豆象免疫信號轉導相關基因尚未鑒定，相關基因的表達量與種群密度的關系仍不清楚。鑒于此，本研究嘗試從四紋豆象轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定免疫信號轉導及抗菌肽相關基因，并闡明這些基因表達量與種群密度的關系。

1 材料和方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

野生四紋豆象經(jīng)形態(tài)和細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ測序鑒定后，于2016年7月將其引入并飼養(yǎng)。組織培養(yǎng)瓶(0.2 L)蓋上開5 cm × 5 cm孔，用紗布封住，既保證透氣又防止四紋豆象逃逸。在盛有100粒黑綠豆的瓶中置入2對豆象，以建立低密度試驗種群。在盛有相同數(shù)量黑綠豆的瓶中置入15對豆象，以建立高密度試驗種群。飼養(yǎng)5代后開始試驗，每個密度設立3個生物重復。飼養(yǎng)條件：溫度為(30±2)℃，光周期L∶D為16∶8，相對濕度為50%～70%。

1.2 Toll、IMD與抗菌肽基因的鑒定

從FlyBase中下載黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)Toll與IMD相關蛋白質序列：Toll-1(CG5490)、Toll-2(CG8896)、Toll-3(CG1149)、Toll-4(CG18241)、Toll-5(CG7121)、Toll-6(CG7250)、Toll-7(CG8595)、Toll-8(CG6890)、Toll-9(CG5528)、IMD(CG5576)、肽聚糖識別蛋白LC[PGRP-LC(CG4432)]。從NCBI中下載赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)Toll、IMD相關蛋白質序列：Toll-1(Tc000176，NCBI：LOC655507)、Toll-2(Tc004452，NCBI：LOC662755)、Toll-3(Tc004438，NCBI：LOC656158)、Toll-4(Tc004439，NCBI：LOC656071)、Toll-6(Tc004895，NCBI：LOC660697)、Toll-7(Tc004474，NCBI：LOC661135)、Toll-8(Tc004898，NCBI：LOC660808)、Toll-9(Tc033974，NCBI：LOC662131)、Toll-10(Tc004901，NCBI：LOC661030)、IMD(XP_008199405.1)、PGRP-LC(XP_008192547.1)。

從FlyBase中下載黑腹果蠅抗菌肽蛋白序列：Drosomycin(CG10810)、Defensin(CG1385)、Cecropin A1(CG1365)、Cecropin A2(CG1367)、Drosocin(CG10816)、Metchnikowin(CG8175)。從NCBI中下載鞘翅目昆蟲抗菌肽蛋白序列：黃粉蟲(Tenebriomolitor)Tenecin-1(BAA04552.1)，東北大黑鰓金龜(Holotrichiadiomphalia)Holotricin-1(2107186A)，三開蜣螂(Copristripartitus)Coprisin(ABP97087.1)，ZophobatratusDefensin B(AAB20745.1)、Defensin C(AAB20746.1)，古銅異麗金龜(Anomalacuprea)Defensin A(BAD77966.1)、Defensin B(BAD77967.1)，犀角金龜(Oryctesrhinoceros)Defensin(BAA36401.1)，獨角仙(Allomyrinadichotoma)Defensin(AAB36306.1)，AcaloleptaluxuriosaDefensin 1(AAK35160.1),Cecropin(BAD66670.1)。鑒于缺乏鞘翅目昆蟲富含脯氨酸抗菌肽信息，而鞘翅目與膜翅目親緣關系相對較近，下載相關膜翅目抗菌肽蛋白序列：意大利蜜蜂(Apismellifera)Apidaecin-1(P35581.1)、Apidaecin-2(Q06601.1)、Abaecin(NP_001011617.1)，紅牛頭犬蟻(Myrmeciagulosa)Formaecin(P81437.1)，BombuspascuorumApidaecin(P81464.1)、Abaecin(P81463.1)，PteromaluspuparumAbaecin-like(ABS44869.1)。

從NCBI下載四紋豆象腹部轉錄組序列[14]。在Bioedit中通過本地tBLASTn比對鑒定相關基因，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)后，在Molecular Evolutionary Genetic Analysis software version 6(MEGA 6)中經(jīng)多重比對(ClustalW)后構建最大似然(Maximum likelihood)進化樹，重復次數(shù)為1 000次。蛋白質序列之間的一致性(Identities)、相似性(Positives)和間隙(Gaps)通過Bioedit軟件計算。蛋白質結構域采用SMART程序(https://smart.embl.de/)預測。

1.3 表達量分析

四紋豆象腹部組織經(jīng)液氮速凍并轉移至-80 ℃保存，部分組織樣品送北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序，以特定基因片段數(shù)量除以其長度后對上述所有序列數(shù)量的比值(Fragments per kilobase of exon per million reads mapped，F(xiàn)PKM)衡量基因表達量。以t檢驗判定相應基因在高密度群體和低密度群體中的表達水平是否存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 四紋豆象Toll與IMD相關基因的鑒定

面對革蘭氏陽性菌和真菌時，昆蟲通過Toll信號通路提升預防性免疫，而面對革蘭氏陰性菌時，昆蟲通過IMD信號通路提升預防性免疫。與病原體感染相似，高種群密度可提升昆蟲的預防性免疫。為揭示種群密度調控四紋豆象免疫反應的信號通路，從四紋豆象腹部轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定到Toll信號通路的關鍵受體基因Toll-1、Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10；IMD信號通路的胞內關鍵信號分子基因IMD和受體基因PGRP-LC(肽聚糖識別蛋白LC基因)(表1)。

表1 四紋豆象Toll與IMD基因序列號Tab.1 Sequence numbers of Toll and IMD genes in Callosobruchus maculatus

通過轉錄組所得Toll相關基因的部分序列，Toll-1、Toll-8、Toll-10序列較短而Toll-3、Toll-6、Toll-7序列較長(圖1A)。將四紋豆象Toll基因序列翻譯為蛋白質序列后進行結構域預測，發(fā)現(xiàn)Toll-1有3個富含亮氨酸重復(Leucine-rich repeats，LRR)、3個典型富含亮氨酸重復(Leucine-rich repeats typical，LRR_TYP)。Toll-3有9個富含亮氨酸重復、3個典型富含亮氨酸重復、1個富含亮氨酸重復的N端結構域(Leucine-rich repeat N-terminal domain，LRR-NT)、1個跨膜區(qū)(Transmembrane region，TR)、1個Toll-白細胞介素1抗性結構域(Toll-interleukin 1-resistance，TIR)。Toll-6有17個富含亮氨酸重復、4個典型富含亮氨酸重復、1個富含亮氨酸重復的C端結構域(Leucine-rich repeat C-terminal domain，LRR-CT)、1個富含亮氨酸重復的N端結構域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細胞介素1抗性結構域。Toll-7有15個富含亮氨酸重復、6個典型富含亮氨酸重復、2個富含亮氨酸重復的C端結構域、1個富含亮氨酸重復的N端結構域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細胞介素1抗性結構域。Toll-8具有3個富含亮氨酸重復、1個典型富含亮氨酸重復、1個富含亮氨酸重復的N端結構域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細胞介素1抗性結構域。Toll-10具有12個富含亮氨酸重復、5個典型富含亮氨酸重復。TIR結構域長度為140個氨基酸左右，是信號傳導所必需的，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，35個位點氨基酸高度保守(圖1B)。

A：Toll蛋白結構域；B：Toll-白細胞介素1抗性結構域蛋白質序列比對。為高度保守位點，下同

在Toll-1氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、50%、10%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、47%、8%。在Toll-3氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為39%、58%、2%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為22%、42%、16%。在Toll-6氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性高達85%，相似性高達93%，間隙為0；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性為58%，相似性為75%，間隙為2%。在Toll-7氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為81%、89%、2%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為56%、69%、10%。在Toll-8氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為83%、93%、0；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為51%、66%、10%。果蠅缺乏Toll-10，而四紋豆象和赤擬谷盜中都鑒定到Toll-10，二者Toll-10氨基酸一致性、相似性、間隙分別為77%、88%、0。由此可見，Toll-1、Toll-3、Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6進化速率依次降低(圖2A)。

在IMD氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為42%、58%、4%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為31%、50%、14%。在PGRP-LC氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為42%、59%、9%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、46%、14%。由此可見，IMD和PGRP-LC的進化速率與Toll-3相似(圖2B)。

A：Toll進化樹；B：IMD與PGRP-LC進化樹

2.2 四紋豆象Toll、IMD相關基因表達量與種群密度的關系

在四紋豆象腹部組織中，Toll-1基因表達水平最低，其FPKM值為0.32。除Toll-1的表達量不受種群密度影響外(t=0.05，P=0.960)，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10的表達量在高密度群體中顯著或極顯著上調(圖3)。其中，Toll-10上調1.1倍(t=4.3，P=0.010)，Toll-8上調1.2倍(t=6.21，P=0.003)，Toll-6上調1.0倍(t=6.65，P=0.003)，Toll-3上調0.6倍(t=10.72，P=0.002)。Toll-7表達水平最高，其在高密度群體和低密度群體中的FPKM值分別為127.25、57.92，在高密度群體中上調1.2倍(t=5.67，P=0.005)。IMD和PGRP-LC的表達量未出現(xiàn)明顯上調。

H：高密度；L：低密度。*、**分別表示高密度和低密度群體中基因表達量差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同

2.3 四紋豆象抗菌肽基因的鑒定與表達量分析

革蘭氏陽性菌和真菌可激活昆蟲的Toll信號通路進而激活抗菌肽表達，而革蘭氏陰性菌通過激活IMD信號通路進而激活抗菌肽表達?？咕氖抢ハx抵御病原體入侵的重要防線。由表2可知，從轉錄組中共鑒定到7個抗菌肽基因：1個Defensin(防御素基因)、1個Cecropin(天蠶素基因)、2個Apidaecin(蜜蜂抗菌肽基因)、3個Drosomycin(抗真菌肽基因)。

表2 四紋豆象抗菌肽基因序列號Tab.2 Sequence numbers of antimicrobial peptide genes in callosobruchus maculatus

在Cecropin序列相似性方面，四紋豆象與近緣物種A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、間隙分別為46%、67%、0，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為32%、46%、4%(圖4A)。在Defensin序列相似性方面，四紋豆象與近緣物種A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、間隙分別為46%、73%、1%,四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為32%、48%、19%。在Apidaecin-1序列相似性方面，四紋豆象與蜜蜂氨基酸一致性、相似性、間隙分別為33%、42%、13%。在Apidaecin-2序列相似性方面，四紋豆象與蜜蜂氨基酸一致性、相似性、間隙分別為28%、35%、13%。四紋豆象的Apidaecin-1與Apidaecin-2氨基酸一致性、相似性、間隙分別為30%、38%、15%。在Drosomycin-1序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為82%、89%、4%。在Drosomycin-2序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為69%、81%、3%。在Drosomycin-3序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為86%、88%、4%。在四紋豆象的Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3蛋白序列相似性方面，任意二者的一致性均為95%、相似性均為100%。在核苷酸水平上，Drosomycin-1與Drosomycin-2的一致性為93%；Drosomycin-1與Drosomycin-3的一致性為81%；Drosomycin-2與Drosomycin-3的一致性為83%(圖4B)。由此可見，Drosomycin-3在進化中最保守。

在表達量方面，Apidaecin-1表達量最低，其FPKM值為6.58(圖4C)。種群密度對Apidaecin-1、Cecropin和Apidaecin-2的表達量無顯著影響。Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3分別在高密度群體中上調6.6倍(t=7.07，P=0.002)、2.5倍(t=5.58，P=0.005)、1.8倍(t=11.70，P=0.000 3)。Defensin表達量最高，高密度群體和低密度群體的FPKM值分別為1 277.23和683.87，其在高密度群體中上調0.9倍(t=4.18，P=0.025)。

Acu：古銅異麗金龜;Adi：獨角仙;Alu：Acalolepta luxuriosa;Ame：意大利蜜蜂;Bpa：Bombus pascuorum;Ctr：三開蜣螂;Hdi：東北大黑鰓金龜;Mgu：紅牛頭犬蟻;Orh：犀角金龜;Ppu：Pteromalus puparum;Tmo：黃粉蟲;Zat：Zophob atratus

3 結論與討論

Toll信號通路負責革蘭氏陽性菌和真菌信號傳導,本研究共從四紋豆象腹部轉錄組中鑒定到6個Toll信號通路受體基因，其蛋白質都有富含亮氨酸的結構域。其中，Toll-1進化速率較快，Toll-3進化速率略慢于Toll-1，而Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6緊隨其后，進化速率依次降低。革蘭氏陰性菌主要通過IMD信號通路傳導。本研究從腹部轉錄組中鑒定到IMD信號通路的胞內關鍵信號分子基因IMD和受體基因PGRP-LC。IMD和PGRP-LC的進化速率與Toll-3相似。

表達量方面，除Toll-1外，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10在高密度群體中上調。其中，Toll-7表達量最高。果蠅中Toll-7和Toll-10參與胚胎時期前后軸延伸[10]，Toll-8參與胚胎時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腿發(fā)育[9]。四紋豆象在高密度條件下個體發(fā)育更迅速、性成熟更早、后代胚胎發(fā)育更快速和整齊。四紋豆象腹部主要包括脂肪體和卵巢，其均參與繁殖過程。上調的Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能參與雌性個體發(fā)育、性成熟及后代的胚胎發(fā)育。與此相似，家蠶Toll基因在卵巢中高表達，其可能參與胚胎發(fā)育[11]。除調控發(fā)育功能外，Toll的重要作用是參與免疫信號轉導，革蘭氏陽性菌、真菌和病毒可激活Toll信號通路，從而激活抗菌肽表達。如Toll-7可激活抗病毒自噬反應[6]，通過自噬抑制病毒復制[7]。Toll-8可負調控呼吸道上皮抗微生物反應[8]。果蠅中Toll-1可明顯調控免疫反應，其過表達可誘導抗菌肽表達[5]。在四紋豆象中，Toll-1表達量最低且種群密度對其表達量無顯著影響，因此，Toll-1在四紋豆象種群密度引起的免疫信號轉導過程中不起關鍵作用。種群密度對IMD和PGRP-LC表達量無明顯調控作用，因此，IMD信號通路在種群密度引起的免疫信號轉導中不起關鍵作用。由此可見，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能在種群密度引起的免疫信號轉導中具有重要作用。

革蘭氏陽性菌和真菌可激活昆蟲的Toll信號通路而激活抗菌肽表達，而革蘭氏陰性菌通過激活IMD信號通路而激活抗菌肽表達[4]。抗菌肽是昆蟲抵御病原體入侵的重要防線。本研究從轉錄組中共鑒定到7個抗菌肽基因： 1個Cecropin、1個Defensin、2個Apidaecin、3個Drosomycin。其中，Cecropin、Apidaecin-1和Apidaecin-2的表達量在高密度群體中無顯著上調或下調，而Defensin和3個Drosomycin在高密度群體中顯著上調。高種群密度通過上調Defensin和3個Drosomycin的表達量提升昆蟲的預防性免疫能力，降低個體被感染的概率。Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10與Defensin、Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3的調控關系仍不清楚，有待于進一步研究。

四紋豆象免疫信號與抗菌肽相關基因的鑒定及表達量分析有利于進一步揭示相關基因在免疫應答和個體發(fā)育中的作用，闡明種群密度介導的預防性免疫的具體分子途徑。