馬陽陽 王平 胡文婷 徐永平 張小燕 黎釗 虞聞仲 朱蒙燕 許愛娥

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州310009；2杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009；3浙江省義烏市皮膚病醫(yī)院皮膚科322000

泛素化是一種翻譯后修飾，在細(xì)胞周期、增殖及凋亡中發(fā)揮重要作用，它將泛素與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)結(jié)合，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由3種酶即泛素活化酶、泛素結(jié)合酶2（UBE2）和泛素連接酶組成［1］。作為一種泛素結(jié)合酶，UBE2S又稱E2-EPF UCP，具有高度保守的150個(gè)氨基酸核心結(jié)構(gòu)，與泛素連接酶后期促進(jìn)復(fù)合物（APC/C）結(jié)合，拉長(zhǎng)靶蛋白上的泛素鏈，促使底物降解，其異常調(diào)控參與炎癥因子核因子κB與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、促有絲分裂生長(zhǎng)因子和缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，驅(qū)動(dòng)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移［2-3］。既往研究顯示，UBE2S在多種疾病中表達(dá)上調(diào)，包括宮頸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）、乳腺癌及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌等惡性腫瘤，并與腫瘤生長(zhǎng)、G2/M期阻滯密切相關(guān)［3-4］。然而，有關(guān)UBE2S在惡性黑素瘤（MM）中的研究報(bào)道極少，其作用機(jī)制尚不清楚。我們通過檢測(cè)UBE2S在MM組織中的表達(dá)，了解其與腫瘤分期（化）的相關(guān)性，并通過研究UBE2S對(duì)MM細(xì)胞功能及侵襲性的影響，探討其對(duì)MM預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，為篩選MM分子治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料

黑素瘤細(xì)胞株（A375、MUM-2B及MUM-2C）、293T細(xì)胞及慢病毒表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P公司提供，DMEM培養(yǎng)基（美國Corning公司），胎牛血清（美國Ausbian公司），MM及正常組織芯片+標(biāo)記點(diǎn)（西安艾麗娜生物科技有限公司，貨號(hào)ME2082c），兔抗UBE2S抗體（美國Sigma公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG抗體（美國Sigma公司），兔抗N-鈣黏蛋白抗體（美國CST公司），鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Santa-Cruz公司），Vulcan fast red chromogen kit2染色液（美國Concord公司），Trizol試劑（上海普飛生物技術(shù)有限公司），M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒（美國Promega公司），SYBR premix ex tap PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），凋亡檢測(cè)試劑盒（美國eBioscience公司），碘化丙錠（美國Sigma公司），流式細(xì)胞儀（美國Millipore公司），Transwell試劑盒及侵襲檢測(cè)試劑盒（美國Corning公司），熒光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.免疫組化檢測(cè)MM組織中UBE2S基因的表達(dá)：MM及非瘤組織芯片共208例，包括原發(fā)性MM 128例、轉(zhuǎn)移性MM 64例、非瘤組織16例（瘤旁組織及正常表皮組織各8例）。將組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，用10%血清封閉30 min；加入一抗（兔抗UBE2S抗體1∶100）孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）沖洗；加入二抗（兔抗人IgG抗體）孵育60 min，TBS沖洗。用Vulcan fast red chromogen kit2染色試劑按照說明書染色。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①按染色強(qiáng)度評(píng)分，分為0～34個(gè)等級(jí)；②按染色陽性率評(píng)分：陰性為0，1%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，76%～100%為4。按染色強(qiáng)度和染色陽性率乘積值分組，≤6分為抗體低表達(dá)組，＞6分為抗體高表達(dá)組。

2.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)黑素瘤細(xì)胞株中UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)水平：使用Trizol試劑分別提取A375、MUM-2B及MUM-2C細(xì)胞株總RNA，分別取2μg樣本使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR premix ex tap PCR試劑盒按說明書擴(kuò)增目的基因。由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成引物。UBE2S正向引物5′-GTGCTCAAGAGGGACTGGACG-3′，反向引物5′-GCAGACTCGGGGTTAGGGTG-3′，片段大小為92 bp。GAPDH正向引物5′-TGACTTCAAC AGCGACACCCA-3′，反向引物5′-CACCCTGTTGTA GCCAAA-3′，片段大小為121 bp。采用兩步法反應(yīng)，條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，以2-△△Ct表示UBE2S相對(duì)表達(dá)水平，其中△Ct=目的基因Ct值-GAPDH基因Ct值，△△Ct=各樣品△Ct值-對(duì)照組△Ct值。

3.UBE2S基因shRNA慢病毒感染A375及MUM-2B細(xì)胞：用病毒包裝輔助質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P公司）與攜帶目標(biāo)序列miRNA的GV115質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行慢病毒的濃縮與純化。將A375及MUM-2B細(xì)胞分別分為兩組，干擾組使用含有UBE2S RNA干擾序列（5′-ACATCATCCGCCTGGTGTA-3′）的慢病毒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組使用含有對(duì)照序列（5′-TTCTCCGAACGT GTCACGT-3′）的慢病毒轉(zhuǎn)染，72 h后，熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，熒光率達(dá)70%～80%時(shí)收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)水平，方法同前。

4.各組細(xì)胞中caspase3/7的表達(dá)檢測(cè)：將經(jīng)過上述處理的A375及MUM-2B細(xì)胞計(jì)數(shù)并按照1×104細(xì)胞/孔加入96孔板中。使用Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒按照說明書檢測(cè)細(xì)胞中caspase3/7的表達(dá)。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期情況：將經(jīng)過上述處理的A375、MUM-2B細(xì)胞在6孔板中傳代培養(yǎng)至覆蓋率為80%，胰酶消化，1 300 r/min（離心半徑為20 cm）離心5 min后，向部分細(xì)胞中加入10μl膜聯(lián)蛋白V-別藻藍(lán)蛋白在室溫下染色15 min，另一部分加入0.7 ml碘化丙錠染色液使上機(jī)時(shí)細(xì)胞通過率為300～800個(gè)/s，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期情況。

6.Transwell法分析細(xì)胞遷移及侵襲能力：將干擾組與對(duì)照組A375細(xì)胞按8×104/孔接種，分別取細(xì)胞懸浮液100μl加入Transwell小室上室，下室加600μl 30%胎牛血清培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)16 h后使用Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞2～3 min后觀察并拍照。每個(gè)Transwell小室隨機(jī)選取3個(gè)200×視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

取侵襲試劑盒上室鋪Matrigel基質(zhì)加入細(xì)胞懸浮液500μl，下室加750μl 30%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h后染色3～5 min，每個(gè)小室隨機(jī)選取3個(gè)200×視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7.Western印跡法檢測(cè)N-鈣黏蛋白的表達(dá)：取干擾組與對(duì)照組A375細(xì)胞用PBS洗滌，冰上裂解10～15 min后超聲破碎細(xì)胞，取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)濃度標(biāo)化后進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。取20μg總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上室溫下封閉1 h。加入一抗兔抗N-鈣黏蛋白（1∶500），以鼠抗GAPDH（1∶2 000）為內(nèi)參照，室溫孵育1 h，用TBST洗滌聚偏二氟乙烯膜后加入對(duì)應(yīng)的N-鈣黏蛋白標(biāo)記的兔抗人IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。洗膜后采用Pierce?ECL Western Blotting Substrate試劑盒（美國Thermo公司）進(jìn)行X光顯影，并按說明書要求進(jìn)行X線膠片處理。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。使用SPSS 22.0軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。用Spearman秩相關(guān)系數(shù)評(píng)估UBE2S表達(dá)與腫瘤分期的相關(guān)性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、UBE2S在MM組織中的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)顯示，UBE2S在MM及非瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。192例MM組織中，98例（51.0%）高表達(dá)UBE2S；16例非瘤組織中未見高表達(dá)，高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.905，P＜0.01）。UBE2S在不同T分期的瘤組織中表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.110，P=0.044）。Spearman秩相關(guān)分析提示該基因在瘤組織中的表達(dá)水平與患者的T分期呈負(fù)相關(guān)（斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)ρ=-0.210，P=0.043）。見表1、圖1。

表1 泛素結(jié)合酶2S（UBE2S）在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)性分析（例）

二、A375、MUM-2B、MUM-2C細(xì)胞株UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)水平

A375、MUM-2B、MUM-2C細(xì) 胞 內(nèi)UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.96±0.12、8.91±0.06、5.25±0.15，表達(dá)豐度都較高，不同細(xì)胞之間UBE2S mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=817.228，P＜0.01），以MUM-2B細(xì)胞株表達(dá)量最高，其后依次為A375、MUM-2C細(xì)胞株，選擇A375及MUM-2B細(xì)胞株進(jìn)行shRNA慢病毒感染。

三、shRNA轉(zhuǎn)染效率及對(duì)UBE2S mRNA表達(dá)的影響

將shRNA轉(zhuǎn)染的4組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)算轉(zhuǎn)染效率在80%以上，細(xì)胞狀態(tài)正常。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示，干擾組及對(duì)照組A375細(xì)胞UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.312±0.005、1.001±0.042，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-28.052，P=0.001）；干擾組及對(duì)照組MUM-2B細(xì)胞UBE2S mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.548±0.083、1.002±0.072，兩組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.188，P=0.002）。

四、敲減UBE2S基因?qū)谒亓黾?xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

感染3 d后，干擾組與對(duì)照組A375細(xì)胞caspase3/7活性分別為14 522.7±138.25與7 351.7±693.18，干擾組顯著高于對(duì)照組（t=17.572，P＜0.01）；干擾組較對(duì)照組MUM-2B細(xì)胞caspase3/7活性亦明顯增加（分別為17 276.3±178.959、12 442.3±290.294，t=24.552，P＜0.01）。與對(duì)照組A375及MUM-2B細(xì)胞相比，干擾組A375及MUM-2B細(xì)胞凋亡率顯著增加（均P＜0.01）。與對(duì)照組A375細(xì)胞相比，干擾組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯增多（P＜0.01），而S期細(xì)胞明顯減少（P＜0.01），G2/M期細(xì)胞無明顯變化（P＞0.05）.與對(duì)照組MUM-2B相比，干擾組MUM-2B細(xì)胞G1期（P＜0.01）、G2/M期（P＜0.01）比例明顯增多，S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）。見圖2、表2。

圖3 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細(xì)胞遷移、侵襲的影響（×200）

表2 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細(xì)胞及MUM-2B細(xì)胞凋亡率與周期分布的影響（%，±s）

表2 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細(xì)胞及MUM-2B細(xì)胞凋亡率與周期分布的影響（%，±s）

注：n=3

組別A375細(xì)胞對(duì)照組干擾組t A375值P A375值MUM-2B細(xì)胞對(duì)照組干擾組t MUM-2B值P MUM-2B值凋亡率G1期S期G2/M期4.58±0.15 8.26±0.18 27.236 0.001 59.85±1.48 67.21±0.90 7.365 0.002 31.75±0.67 24.66±1.34-9.190 0.001 8.40±1.99 8.13±0.61-0.227 0.831 4.40±0.13 7.07±0.13 25.374 0.001 36.55±0.19 38.70±0.22 12.676 0.001 45.42±0.55 37.23±0.72-15.718 0.001 18.03±0.58 24.08±0.56 13.045 0.001

五、敲減UBE2S基因?qū)375細(xì)胞遷移、侵襲能力及N-鈣黏蛋白表達(dá)的影響

見圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組和干擾組A375細(xì)胞每200×視野轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)分別為260±9.3、51±3.7，干擾組A375細(xì)胞遷移能力顯著降低（t=-35.727，P＜0.05）。侵襲小室實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組和干擾組A375細(xì)胞透過Matrigel基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)分別為109±0.8、26±0.7，干擾組細(xì)胞侵襲能力顯著降低（t=-125.000，P＜0.01）。Western印跡檢測(cè)顯示，A375細(xì)胞敲減UBE2S基因后，N-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4）。

圖4 敲減泛素結(jié)合酶2S對(duì)A375細(xì)胞N-鈣黏蛋白表達(dá)的影響

討 論

與普通免疫組化切片相比，組織芯片技術(shù)可以大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化地在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平進(jìn)行研究，在腫瘤相關(guān)基因研究中發(fā)揮重要作用［5］。我們使用MM及非瘤組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，并且結(jié)合臨床資料進(jìn)行判讀。本研究表明，UBE2S在MM組織中明顯高表達(dá)，而瘤旁組織及正常對(duì)照組織低表達(dá)，提示UBE2S可能與MM的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，可作為MM的免疫標(biāo)志之一。UBE2S在OSCC中的表達(dá)水平與腫瘤分期呈正相關(guān)［4］。本研究顯示，UBE2S在T1/T2/T3期MM中呈高表達(dá)，而T4期表達(dá)水平卻明顯下降，提示黑素瘤細(xì)胞可能具有不同于其他惡性腫瘤的細(xì)胞分化特征，也反映了MM顯著的異質(zhì)性。

本研究結(jié)果顯示，UBE2S在A375、MUM-2B、MUM-2C細(xì)胞中表達(dá)豐度都為高，以MUM-2B表達(dá)量最高，其次為A375、MUM-2C。而且，敲減UBE2S基因后，黑素瘤細(xì)胞凋亡水平明顯增高，細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著降低，證實(shí)UBE2S對(duì)MM細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。UBE2S過表達(dá)被報(bào)道與OSCC［4］、腎癌［6］及食管癌［7］的細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力上調(diào)有關(guān)，但敲減UBE2S基因?qū)m頸癌及乳腺癌細(xì)胞增殖無明顯影響［8-9］。Yoshimura等［4］報(bào)道敲減OSCC細(xì)胞UBE2S基因，可通過促進(jìn)P21降解抑制G2/M期細(xì)胞增殖。而Tedesco等［9］報(bào)道在乳腺腫瘤中，UBE2S常與細(xì)胞周期G2/M期的基因共同表達(dá)。本研究顯示，敲減UBE2S基因的黑素瘤細(xì)胞阻滯于G1/S期，進(jìn)一步表明UBE2S在不同來源腫瘤中的功能差異。

UBE2S參與Von Hippel-Lindau泛素（VHL）的蛋白酶體降解，VHL介導(dǎo)HIF1α的泛素化降解，HIF刺激原癌發(fā)生和促分裂生長(zhǎng)因子相關(guān)基因表達(dá)［10］。UBE2S與HIF1α在胰腺癌、黏液性結(jié)腸癌、乳腺癌中過度表達(dá)，而VHL表達(dá)下調(diào)［9-10］。UBE2S在轉(zhuǎn)移性皮膚癌CAKI細(xì)胞和人黑素瘤C8161細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過HIF1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)VHL降解，促進(jìn)細(xì)胞增殖［10］。研究發(fā)現(xiàn)，UBE2S可能通過調(diào)節(jié)VHL/HIF1α—TGF-β1通路來誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程［7，11］。EMT是一種由上皮向間充質(zhì)細(xì)胞型轉(zhuǎn)變的生物學(xué)過程，是腫瘤侵襲過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程降低腫瘤轉(zhuǎn)移中細(xì)胞黏附并促進(jìn)細(xì)胞脫落［12-13］。在此過程中，黏附分子N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞失去極性，形成有利于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的遷移、侵襲和抗凋亡特性［13］。本研究顯示，敲減UBE2S基因后，A375細(xì)胞中N-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，提示UBE2S可能通過調(diào)控EMT過程中的N-鈣黏蛋白促進(jìn)MM細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，UBE2S在MM組織中高表達(dá)且與患者腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，敲減UBE2S基因后MM細(xì)胞遷移、侵襲和EMT過程受到抑制，細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，提示UBE2S可能作為關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因影響MM的發(fā)展和預(yù)后，為篩選MM分子治療的靶點(diǎn)提供了部分理論基礎(chǔ)，但具體機(jī)制和應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突