趙雅洲

研究背景

鹿花盤是梅花鹿或馬鹿鋸茸后，在鹿角基部留下的茸角骨化后，在下一個生茸期開始時脫落的部分。鹿花盤是我國一種傳統(tǒng)名貴的中藥，具有抗炎作用，用于治療乳腺炎、風濕關節(jié)炎等。在實際臨床應用中常將鹿花盤熬制成鹿角膠。然而，由于鹿花盤異常堅硬，熬制鹿角膠費時費力，資料顯示其提取率只有17%。本課題主要研究如何提高鹿花盤的提取率，以提高其利用率。

鹿花盤中主要的有效成分是蛋白質(zhì)。食品加工技術中經(jīng)過膨化可以使玉米蛋白質(zhì)得到降解，使蛋白質(zhì)熟化變性利于吸收。膨化過程中，蛋白質(zhì)分子結構伸展、二硫鍵等次級鍵部分斷裂，使其結構發(fā)生變化，由原來緊密有序的結構變成了松散無規(guī)則的構象，易被水解，從而使蛋白質(zhì)的物理、化學特性得以改善，提取率顯著提高。因此，物理方法在提高提取率方面有很好的效果，如果將膨化和酶解法相結合，理論上會使大分子物質(zhì)斷裂得更為充分，更能增加水溶的概率。

因此，我想對鹿花盤提取方法進行改進，將鹿花盤膨化后，使用酶裂解的方法提取鹿花盤提取物，獲得較高的提取率。最關鍵的部分是對提取物的特性進行研究，以驗證提取效果，為鹿花盤的深加工建立新方法。

研究過程

膨化條件的優(yōu)化

將鹿花盤用中藥粉碎機粉碎后磨成細粉，分別過100目和300目篩子，制備成100目細粉和300目超微粉。分別稱取等量鹿花盤塊、100目鹿花盤粉、300目超微粉，使用單螺桿膨化機膨化，測定膨化樣品的直徑。以徑向膨化率表示膨化度（徑向膨化率一平均直徑/?？字睆剑?，并通過體視學顯微鏡測定未膨化和膨化鹿花盤粉的顯微結構。本研究主要考查3個因素對鹿花盤膨化度的影響：溫度、含水量、壓強。

結果顯示，本實驗條件下最適宜的物料粒度為100目;根據(jù)不同溫度、模頭壓強和物料含水量對鹿花盤膨化度的單因素影響，在本實驗條件下最適宜的膨化溫度為120℃、模頭壓強為4Mpa、物料含水量為25%。在這一條件下，經(jīng)過水提法提取膨化鹿花盤粉（PP）有效成分提取率為30.23%，較未膨化鹿花盤粉（AP）的提取率提高了9.56%。

鹿花盤的酶解條件優(yōu)化

選取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶4種蛋白酶對AP和PP進行酶解，對單酶篩選中提取率最高的蛋白酶進行單因素條件優(yōu)化。

PP對4種單酶的酶解提取率均高于AP。且在膨化和未膨化鹿花盤粉中，胃蛋白酶酶解鹿花盤的提取率最高，中性蛋白酶酶解的提取率最低。由此選擇胃蛋白酶作為膨化鹿花盤單酶解和正交實驗中的主要酶。隨著料液比的增加，提取率持續(xù)增長且越來越平緩;當加酶量達到4%時，提取率最高，而后呈下降趨勢;隨著酶解時間的加長，提取率逐漸升高，考慮實際生產(chǎn)利用率等問題，選擇2h、4h和6h作為酶解時間范圍。

根據(jù)胃蛋白酶單因素條件摸索的范圍，以提取率為評價指標，得到胃蛋白酶單因素提取范圍：料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解溫度37℃。利用最佳酶解條件對PP進行酶解，最終提取率達到36.39%。

鹿花盤膠原蛋白的特性研究

◇抗氧化活性測定實驗

鹿花盤在治療乳腺增生、抗疲勞、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面的功效顯著，而這些疾病常常與人體產(chǎn)生的自由基及其誘導的氧化反應密切相關，清除自由基也被廣泛認為可延緩人體衰老和預防疾病。因此，通過對不同提取方法的鹿花盤提取物進行體外抗氧化活性的測定，可以全面地了解和掌握鹿花盤抗氧化特性。

分別取AP的提取液（AB）、PP的提取液（PB）和膨化的鹿花盤酶解提取液（MB）作為樣品，利用三氯化鐵還原法和DPPH清除自由基法進行實驗。結果發(fā)現(xiàn)，提取方法不同，3種鹿花盤提取物抗氧化能力略有不同，但均具有良好的抗氧化特性，其中膨化酶解后鹿花盤提取物抗氧化能力最強，膨化鹿花盤水提取物次之，未處理鹿花盤水提取物最弱。這說明鹿花盤的抗氧化活性可以隨著提取方法的深入而呈現(xiàn)上升趨勢，并且隨著提取物濃度的增大，總還原力和DPPH自由基清除能力增強。

抗炎活性驗證實驗

鹿花盤具有顯著的抗炎作用。本實驗利用鹿花盤提取物對脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7炎癥模型進行作用。對比不同提取條件下的鹿花盤提取物對炎癥細胞的影響。結果表明，不同的鹿花盤提取物能有效抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應。其抗炎作用可能與釋放NO、TNF-a、IL-1B和IL-6有關，且PB對抑制3種促炎細胞因子的效果更加顯著。

線蟲模型效果驗證實驗

本實驗利用線蟲，對不同方法處理后的鹿花盤提取物進行抗衰老、抗疲勞方面的效果驗證，為后期相關鹿花盤產(chǎn)品的開發(fā)提供理論和數(shù)據(jù)支持。

·對線蟲壽命的影響：本實驗中我們選定的不同提取方式的鹿花盤提取物給藥濃度均為1mg/mL，陽性對照白藜蘆醇濃度為100uM。實驗結果表明，AB組對線蟲壽命沒有顯著影響，PB組和MB組均能明顯延長線蟲的壽命，且MB組的作用效果稍強于陽性對照白藜蘆醇。

·對線蟲運動的影響：實驗第1～6天，各組線蟲運動形式均為A型，第10天開始有所不同，給藥組A型線蟲均多于對照組。從第14天和第18天的結果可以看出給藥組線蟲的運動狀態(tài)明顯好于對照組，且PB和MB組線蟲運動狀態(tài)好于AB組。

·對線蟲吞咽頻率的影響：在線蟲生命初期（第1～5天），給藥組和對照組的吞咽頻率無明顯差異，第9～17天觀察結束，給藥組與對照組有顯著差異（P<0.05）。說明不同處理方式的鹿花盤提取物均能不同程度地增強線蟲的吞咽頻率，提高晚期線蟲生存狀態(tài)，且PB和MB組效果好于AB組。

根據(jù)上述實驗結果，鹿花盤提取物能明顯延長野生型線蟲的壽命，提高線蟲的運動狀態(tài)，在線蟲生存晚期效果更加明顯，鹿花盤提取物給藥組A、B型線蟲數(shù)目明顯多于對照組。鹿花盤提取物能提高線蟲吞咽頻率，增強咽部吞咽能力，具有明顯抗衰老、抗疲勞的作用，且鹿花盤膨化處理及酶解處理后效果更顯著。

總結

本次研究創(chuàng)造性地將物理和生物化學方法相結合，設計了一套高效的鹿花盤提取方法，并對該方法的各個環(huán)節(jié)進行條件摸索和優(yōu)化，通過離體模型（體外實驗和細胞模型）和活體模型對鹿花盤提取物抗氧化、抗炎、延緩衰老和抗疲勞等功效進行了驗證，發(fā)現(xiàn)通過粉碎、膨化、酶解后的鹿花盤提取物的效果明顯好于傳統(tǒng)提取方法。

◇通過粉碎、膨化、酶解3個步驟，將鹿花盤膠原蛋白的提取時間縮短到1天之內(nèi)，提取率提高到了36.39%，相比鹿角塊水煮的提取率提高了將近1倍，相比熬制鹿角膠耗時4～7天，藥典記載的17%的提取率提高了1倍多。

◇確定了鹿花盤膨化的最佳提取粒度為100目，最佳膨化條件為膨化溫度120℃、模頭壓強4Mpa、物料含水量25%。

◇最佳酶解提取方法為：使用胃蛋白酶酶解，料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解溫度37℃。

◇分別通過離體、細胞和活體3種生物模型，遞進式地對膨化酶解后的鹿花盤膠原蛋白特性進行分析。發(fā)現(xiàn)抗氧化特性提高了25%;同時顯著提高了抑制炎性巨噬細胞釋放NO的能力，且顯著提高了抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的炎癥反應;顯著延長野生型線蟲的壽命，提高線蟲的運動狀態(tài)和抗疲勞的能力。

該項目獲得第33屆全國青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競賽項目中學組生物醫(yī)學組一等獎。

專家評語

本研究實用性強、思路清晰、設計合理，改裝了裝置，設計了提取流程和優(yōu)化條件，提高了提取率。建議進一步細化提取流程。