李磊 韓成 王宵宵

摘要：為了探究鎘脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤微生物的影響，以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)（HH1）及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63（MH63）為研究材料，設(shè)置不同Cd2+濃度（0、3.5、60.0、240.0 mg/kg）脅迫進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。結(jié)果表明：與Cd0相比，Cd3.5處理對(duì)水稻農(nóng)藝性狀無顯著影響;Cd240.0處理顯著降低了株高、產(chǎn)量;與Cd0處理相比，Cd60.0和Cd240.0處理下HH1水稻根際土壤細(xì)菌群落組成中Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）的相對(duì)豐度顯著降低;MH63水稻中Acidobacteria的相對(duì)豐度顯著升高而Bacteroidetes（擬桿菌門）的相對(duì)豐度顯著降低。Cd脅迫顯著降低了水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度及多樣性。環(huán)境因子分析顯示，Cd脅迫后水稻根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量的變化是影響根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要原因。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;細(xì)菌群落;根際土壤;鎘脅迫

中圖分類號(hào)： S154.3;Q938.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0282-06

近年來，鎘（Cd）污染愈加嚴(yán)重，使得農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展與人類的生態(tài)環(huán)境受到極大影響。Cd在土壤-植物系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的遷移能力，可在作物中富集較高濃度的Cd，經(jīng)食物鏈傳遞進(jìn)入人體危害人類健康[1]。調(diào)查顯示，廣西巖溶地區(qū)自然地理環(huán)境下土壤中的Cd濃度高達(dá)20 mg/kg，遠(yuǎn)高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且我國(guó)西南地區(qū)土壤中Cd含量普遍較高[2]。水稻是我國(guó)重要的糧食作物，同時(shí)也是極易富集Cd的作物。近年來，轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展，2017年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積高達(dá)1.9億hm2[3]。來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因是目前應(yīng)用最為廣泛的抗蟲基因。轉(zhuǎn)入Bt基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，能夠殺死鱗翅類害蟲，大大降低化學(xué)殺蟲劑使用量[4]。在干旱、高鹽及重金屬等逆境脅迫下，與親本水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[5-8]。如在Cd及高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中抗氧化酶含量高于親本水稻[5-6];Li等研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度臭氧脅迫下，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的光合作用、產(chǎn)量均高于親本水稻[7]，且能夠比親本水稻提前適應(yīng)低氮環(huán)境[8]。我國(guó)受重金屬污染較嚴(yán)重地區(qū)土壤Cd污染的平均值達(dá)到3.5 mg/kg，轉(zhuǎn)基因水稻在該濃度Cd脅迫下是否能正常生長(zhǎng)、是否富集Cd目前尚不清楚;而在高Cd濃度脅迫下，與親本水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻是否具有更高的抗Cd能力也有待研究。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量循環(huán)的主要參與者，其活動(dòng)是衡量生態(tài)系統(tǒng)各種功能是否正常的一個(gè)重要方面。土壤微生物群落與土壤重金屬污染之間的關(guān)系是國(guó)內(nèi)外環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，重金屬污染能夠?qū)ν寥赖奈⑸锶郝洚a(chǎn)生影響，如降低土壤微生物量、可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)量等[9]，同時(shí)重金屬污染能明顯改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10]。轉(zhuǎn)基因作物能通過作物殘?bào)w、作物根系分泌物、作物花粉等方式改變根際土壤微環(huán)境，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)。關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)土壤微生物群落的影響，學(xué)者們展開了大量研究，但目前尚未有統(tǒng)一結(jié)論，有學(xué)者通過田間試驗(yàn)監(jiān)測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻與其親本的多樣性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)土壤根際微生物多樣性無顯著影響[11]，也有研究者比較了轉(zhuǎn)基因水稻和常規(guī)水稻根際細(xì)菌類群的數(shù)量和組成，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的根際土壤細(xì)菌數(shù)量少于非轉(zhuǎn)基因水稻，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種水稻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不同[12]。根際土壤微生物是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，其群落豐度、組成易受根際微環(huán)境和水稻生長(zhǎng)影響。但在Cd脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤微生物的研究尚未見報(bào)道。

本研究以轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)（HH1）及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63（MH63）為研究對(duì)象，研究不同Cd濃度脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤微生物的影響，為Cd污染地區(qū)水稻生長(zhǎng)及環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與水稻種子

供試土壤為南京師范大學(xué)仙林校區(qū)（118°55′E、32°06′N）內(nèi)未經(jīng)人為干擾的自然生態(tài)系統(tǒng)土壤，去除表面植被、落葉及顆粒物后，采集0～15 cm深度土壤，室內(nèi)自然風(fēng)干后研磨過篩（2 mm），混勻后備用。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH值為7.77，總氮含量為0.41 g/kg，總有機(jī)碳含量為2.7 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量為4.65 g/kg，速效磷含量為3.53 mg/kg，銨態(tài)氮含量為0.28 mg/kg，該土壤中未檢測(cè)到Cd等重金屬污染。供試水稻為抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)（HH1）及其非轉(zhuǎn)基因親本水稻明恢63（MH63），水稻種子由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院提供。

1.2 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)于2017年4—11月在南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)選用高×直徑為15 cm×25 cm的聚氯乙烯（PVC）塑料桶作為水稻盆栽用桶，每桶稱取相當(dāng)于5.0 kg干土質(zhì)量的風(fēng)干土壤，添加自來水使得盆栽桶中淹水4～5 cm，并添加不同Cd濃度對(duì)土壤進(jìn)行為期30 d的預(yù)處理，盆栽桶口覆膜以減少水分揮發(fā)，膜上有孔以維持通氣狀態(tài)。設(shè)置Cd0、Cd3.5、Cd60.0和Cd240.0共4個(gè)Cd濃度脅迫處理，Cd添加量分別為0、3.5、60.0、240.0 mg/kg，其中Cd3.5為我國(guó)受重金屬污染較嚴(yán)重地區(qū)土壤Cd污染的平均值，本研究具有實(shí)際意義;而Cd60.0和Cd240.0為土壤污染的極端值，擬研究在該高Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的抗Cd潛力。本研究中 Cd（Ⅱ） 的添加形態(tài)為CdCl2·2.5H2O，每個(gè)Cd濃度處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。重金屬預(yù)處理后，每桶施入N ∶ P ∶ K質(zhì)量比為 1 ∶ 1 ∶ 1 的復(fù)合肥作基肥，添加量為1.0 g/kg。將培養(yǎng)20 d后的HH1和MH63水稻幼苗分別移栽至桶中，每桶3株。水稻生長(zhǎng)期間盆內(nèi)保持4～5 cm淹水層，于移栽后20 d追施尿素（0.05 g/kg），于移栽后30 d（水稻分蘗后期）進(jìn)行曬田，其他管理措施與田間相同。成熟期破壞性采樣前，采用微電極分析儀（Unisense Microsensor Multimeter Version 2.01）測(cè)定各處理水稻盆栽水-土界面下3.8 cm處水稻根際土壤氧化還原電位值，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[13]。于移栽后112 d（水稻成熟期），對(duì)水稻植株進(jìn)行破壞性采樣，并測(cè)定株高、生物量、籽粒重金屬含量等水稻農(nóng)藝性狀。采集土樣時(shí)，根據(jù)土壤在植物根系表面抖落和黏著程度來區(qū)分根際土和非根際土，具體采用抖落法收集[14]，將采集的水稻根際土壤的一部分立即裝入2 mL離心管中于 -80 ℃ 保存，用于微生物分子生態(tài)學(xué)分析;一部分根際土用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定 土壤pH值的測(cè)定采用蒸餾水浸提法，以2.5 mL ∶ 1 g的水土比浸提，振蕩10 min并靜置30 min，采用臺(tái)式pH計(jì)（Mettler-Toledo）測(cè)定懸濁液pH值。植物樣品使用HNO3+HClO4消煮后，采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定，土壤有效Cd含量采用土壤養(yǎng)分狀況系統(tǒng)研究法（ASI法）浸提后，采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定;土壤總有機(jī)碳（total soil organic，簡(jiǎn)稱TOC）含量采用日本島津TOC儀測(cè)定;土壤有效磷（AP）含量采用氟化銨-鹽酸提取-鉬銻抗比色法測(cè)定;總氮含量采用凱氏蒸餾法測(cè)定，無機(jī)氮采用2 mol/L KCl按體積比5 ∶ 1水土比浸提，在20 ℃、200 r/min 條件下振蕩1 h后過濾，濾液無機(jī)氮含量用流動(dòng)分析儀（Skalar San Plus，Netherlands）測(cè)定。檢測(cè)方法參考鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[15]。

1.3.2 土壤總DNA的提取 土壤微生物群落與土壤微環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)水平密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，Cd3.5處理對(duì)根際土壤理化性質(zhì)幾乎無影響，因此僅選取Cd60.0和Cd240.0處理根際土壤，作為水稻根際土壤微生物的研究材料，并以Cd0處理為對(duì)照。土壤微生物總DNA采用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，Biomedicals，USA）試劑盒提取。稱取于-80 ℃保存的新鮮土壤樣品0.5 g，按試劑盒的試驗(yàn)步驟提取土壤微生物總DNA。DNA溶液的濃度和純度采用NanoDrop 2000（Thermo，USA）進(jìn)行測(cè)定，提取好的DNA樣品稀釋10倍后保存于 -20 ℃[16]。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用基于SYBR Green染料法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度來表征細(xì)菌群落豐度。測(cè)定儀器為Biorad CFX96 Real-time PCR system（Biorad，USA），SYBR Green試劑選用2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Japan），細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）/907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。反應(yīng)體系為20.0 μL，包括10.0 μL的2×SYBR Premix Ex Taq、上、下游引物（20 μmol/L）各0.3、1.0 μL樣品DNA模版（9.3～23.9 ng/μL）及8.4 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù);采用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，分析程序如下：溫度從65 ℃上升到95 ℃，每上升0.5 ℃采集1次熒光數(shù)據(jù)。以含有細(xì)菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模版，根據(jù)質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算該基因的拷貝數(shù)，分別以10倍梯度稀釋各模板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其濃度范圍為9.61×102～9.61×108 copies/μL。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)，擴(kuò)增效率為99.6%（R2為0.992）。每輪反應(yīng)設(shè)置3個(gè)無模板陰性對(duì)照。

1.3.4 高通量測(cè)序分析 16S rRNA基因擴(kuò)增與Illumina Hiseq高通量測(cè)序分析：16S rRNA基因擴(kuò)增的引物采用515F/907R（V4～V5區(qū)）。高通量測(cè)序委托廣東美格基因有限公司執(zhí)行，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2500。測(cè)序數(shù)據(jù)處理：采用FLASH（v1.2.7，https：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）軟件對(duì)每對(duì)PE reads進(jìn)行拼接，將成對(duì)的reads拼成1條序列，最小的overlap（重疊）長(zhǎng)度設(shè)置為10 bp，拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.1，過濾不符合的Tags（標(biāo)簽），獲得原始的拼接序列。利用Mothur軟件對(duì)拼接后的序列進(jìn)行質(zhì)量控制及過濾，最終得到有效的拼接片段。利用USEARCH軟件（v8.0.1517，http：//www.drive5.com/usearch/）對(duì)所有樣品的全部Clean Tags進(jìn)行聚類，將相似度≥97%的序列歸為同一類操作單元（OTUs），利用Qiime（http：//qiime.org/）從每個(gè)OTU所屬的序列中，選取OTU序列中排在第1位的序列作為OTU的代表序列，為避免測(cè)序深度不同導(dǎo)致的誤差，每個(gè)樣本隨機(jī)抽取17 998條序列參與統(tǒng)計(jì)分析，將代表序列與GreenGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比完成對(duì)各OTU的注釋，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息[17]。根據(jù)樣品中包含的物種信息，在門（Phylum）水平上將相對(duì)豐度<1%細(xì)菌類群以及無法分類的細(xì)菌類群合并在Others。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用SPSS 16.0（IBM，USA）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法來比較不同Cd濃度脅迫處理間的差異性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)土壤理化性質(zhì)及水稻農(nóng)藝性狀的影響

由表1可知，不同Cd濃度脅迫下HH1水稻根際土壤理化性質(zhì)存在顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5處理水稻根際土壤pH值、氧化還原電位（Eh）值顯著降低，Cd60.0處理Eh值顯著降低而總氮與銨態(tài)氮含量顯著升高，Cd240.0處理Eh值與總有機(jī)碳含量顯著降低而總氮與銨態(tài)氮含量顯著增加;與Cd3.5處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理的pH值、銨態(tài)氮含量顯著增加，Cd240.0處理的總氮含量顯著增加，總有機(jī)碳含量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下總有機(jī)碳含量顯著降低而有效鎘含量顯著增加。

不同Cd濃度脅迫下MH63水稻根際土壤理化性質(zhì)也顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5、Cd60.0處理水稻根際土壤的pH值顯著升高，Cd240.0處理水稻根際土壤的pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量均顯著升高;與Cd3.5處理相比，Cd240.0處理的總氮與銨態(tài)氮含量顯著增加;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下有效鎘含量顯著升高。在Cd0處理下，HH1根際土壤pH值顯著高于MH63;在Cd3.5處理下，HH1根際土壤pH值、Eh值顯著低于MH63;在Cd60.0處理下，HH1的Eh值顯著低于MH63;在Cd240.0處理下，HH1的Eh值顯著低于MH63，總有機(jī)碳含量顯著低于MH63。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤Eh值顯著受Cd濃度脅迫及水稻品種的獨(dú)立影響及交互影響，而土壤pH值、總有機(jī)碳含量顯著受Cd濃度脅迫的獨(dú)立影響及Cd濃度與水稻品種的交互影響，水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮、有效鎘含量?jī)H受Cd濃度脅迫影響。可見，Cd濃度增加了水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮、有效Cd含量而種植轉(zhuǎn)基因水稻降低了水稻根際土壤Eh值。

由表2可知，不同Cd濃度脅迫下HH1水稻成熟期農(nóng)藝性狀顯著不同。與Cd0、Cd3.5處理相比，Cd60.0處理生物量顯著降低，Cd240.0處理株高、生物量、產(chǎn)量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理的株高與產(chǎn)量均顯著降低。不同Cd濃度脅迫下MH63水稻的農(nóng)藝性狀也顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5處理農(nóng)藝性狀無顯著差異，Cd240.0處理下水稻株高、產(chǎn)量均顯著降低;與Cd3.5相比，Cd60.0處理株高與產(chǎn)量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下水稻株高、產(chǎn)量均顯著降低。雙因素方差分析顯示，水稻株高、生物量顯著受Cd濃度脅迫及水稻品種的獨(dú)立影響及兩者的交互影響，水稻產(chǎn)量顯著受Cd脅迫獨(dú)立影響及Cd脅迫與水稻品種的交互影響?？梢?，水稻農(nóng)藝性狀顯著受Cd脅迫抑制。

重金屬處理的成熟期水稻各器官中Cd顯著富集，無重金屬處理的各器官中未檢測(cè)到Cd。2個(gè)品種水稻根部Cd含量均隨Cd脅迫濃度增加而顯著上升。單因素方差分析結(jié)果顯示，在Cd3.5、Cd60、Cd240處理下，水稻根中的Cd含量在同一濃度的不同品種間無顯著差異，而同一品種的不同濃度處理間具有顯著差異;在Cd240處理下，HH1、MH63莖中的Cd含量具有顯著差異;在Cd60、Cd240處理下，水稻葉和谷粒中的Cd含量在同一濃度的不同品種間無顯著差異，而不同濃度的同一品種間具有顯著差異。雙因素方差分析顯示，水稻根、葉、谷粒Cd含量顯著受Cd濃度影響?？梢?，水稻根部比莖、葉、谷粒更易富集Cd。

2.2 Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤細(xì)菌群落豐度及Alpha多樣性的影響

由圖1可知，土壤細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)量可以反映土壤細(xì)菌群落豐度。隨著Cd濃度的增加，HH1和MH63水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度呈下降趨勢(shì)。單因素方差分析顯示，部分Cd濃度脅迫下HH1水稻根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理根際土壤細(xì)菌群落豐度顯著降低。MH63水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度間無顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果顯示，根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度僅受Cd濃度脅迫顯著影響和親本水稻根際土壤細(xì)菌群落多樣性。

土壤16S rRNA基因在分類水平上的相對(duì)豐度能反映土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成（圖2）。本研究中的3個(gè)處理共獲取16個(gè)相對(duì)豐度高于1%的門水平上的細(xì)菌類群。各處理中，Proteobacteria（變形菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）Bacteroidetes（擬桿菌門）共5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落，占總細(xì)菌群落的70%以上。其中，Proteobacteria的相對(duì)豐度最高，占總細(xì)菌群落的28.72%～46.63%;Chloroflexi其次，占9.57%～24.72%。

單因素方差分析顯示，HH1水稻根際土壤細(xì)菌群落組成顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0處理中Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria、Actinobacteria、Firmicutes（厚壁菌門）的相對(duì)豐度顯著降低，Bacteroidetes、Fibrobacteres（纖維桿菌門）的相對(duì)豐度顯著升高;Cd240.0處理中Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Fibrobacteres、Nitrospirae（硝化螺旋菌門）的相對(duì)豐度顯著降低而Chloroflexi、Spirochaetes（螺旋體門）的相對(duì)豐度顯著升高;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理中Chloroflexi、Bacteroidetes的相對(duì)豐度顯著升高而OP11、Spirochaetes、Fibrobacteres的相對(duì)豐度顯著降低。單因素方差分析顯示，MH63水稻根際土壤細(xì)菌群落組成也顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0處理中Acidobacteria、Firmicutes、Actinobacteria的相對(duì)豐度顯著升高而Fibrobacteres、Bacteroidetes、OP11的相對(duì)豐度顯著降低，Cd240.0處理中Proteobacteria、Acidobacteria、OP11、Nitrospirae、Actinobacteria、Fibrobacteres的相對(duì)豐度顯著升高而Bacteroidetes、Spirochaetes的相對(duì)豐度顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240處理的Bacteroidetes、OD1的相對(duì)豐度顯著升高而Fibrobacteres、OP11的相對(duì)豐度顯著降低。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤中Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi等11個(gè)細(xì)菌門的相對(duì)豐度受Cd濃度脅迫影響，水稻根際土壤中Other、OP11、Spirochaetes的相對(duì)豐度受水稻品種影響，Chloroflexi、OD1、OP11、Spirochaetes的相對(duì)豐度受水稻品種和Cd濃度的影響?？梢姡珻d濃度脅迫和水稻品種能顯著影響水稻根際土壤細(xì)菌群落組成。

2.3 Cd脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的影響

基于細(xì)菌OTU相對(duì)豐度的CCA分析結(jié)果顯示，各處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化（圖3）。在各Cd濃度脅迫處理下，HH1和MH63根際土壤細(xì)菌群落分布明顯不同，ANOSIM相似度分析表明，各Cd濃度脅迫下根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。但在相同Cd濃度脅迫處理下，HH1和MH63水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。土壤環(huán)境因子分析顯示，根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量、總有機(jī)碳含量和Eh值影響了根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（圖3），其中pH值、總氮含量和銨態(tài)氮含量顯著改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

3.1 Cd脅迫對(duì)水稻生長(zhǎng)及土壤微生物的影響

本研究結(jié)果顯示，Cd脅迫能對(duì)水稻生長(zhǎng)及土壤微生物產(chǎn)生顯著影響。Cd60、Cd240與Cd0處理相比，MH63品種水稻的株高、生物量、產(chǎn)量隨著Cd濃度的增加而降低。余飛宇通過對(duì)水稻添加60、180 mg/kg 2個(gè)Cd濃度脅迫，以不添加Cd脅迫為對(duì)照，結(jié)果顯示，低濃度Cd脅迫下產(chǎn)量比對(duì)照增加了6.71%，高濃度條件下，產(chǎn)量比對(duì)照下降了9.52%，具有顯著差異[18]。王錦文等的研究顯示，Cd脅迫顯著抑制水稻幼苗芽和根的生長(zhǎng)，對(duì)根的生長(zhǎng)影響最為顯著[19]。而龍思斯等的研究結(jié)果顯示，3種不同污染源中，Cd含量對(duì)水稻株高以及稻谷的質(zhì)量無顯著影響[20]。與本研究結(jié)果不一致，這可能與水稻品種、土壤理化性質(zhì)及水稻生長(zhǎng)條件有關(guān)。已有研究顯示，Cd在低濃度時(shí)對(duì)植物有積極的“刺激作用”，在高濃度時(shí)則抑制植物生長(zhǎng)[21-22]。有研究者表示，在重金屬作用下，一方面植物應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，通過加速生理生化活動(dòng)產(chǎn)生大量代謝物與重金屬締合以解毒;另一方面，激活的代謝系統(tǒng)也加速了重金屬的進(jìn)入，進(jìn)而抑制植物的代謝活動(dòng)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[23]。

本研究結(jié)果顯示，隨著Cd濃度的增加，土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度沒有顯著變化，而不同Cd脅迫下MH63水稻根際土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理的Shannon指數(shù)顯著降低，與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理的Shannon指數(shù)顯著降低，表明Cd濃度對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性有顯著影響。ANOSIM相似度分析表明，各Cd脅迫下根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Cd可減少土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量，Cd對(duì)土壤微生物三大菌的抑制效果是細(xì)菌>放線菌>真菌。王秀麗等研究發(fā)現(xiàn)，Cd對(duì)土壤微生物的毒害作用導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量和種群減少，說明Cd的加入導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd濃度是影響水稻株高、生物量、產(chǎn)量及根際土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)的主要因素，同時(shí)土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量顯著影響了水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

3.2 轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與親本水稻MH63相比，HH1水稻的根際土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性、群落組成與結(jié)構(gòu)均沒有顯著變化。而Dunfield等研究了在加拿大的4個(gè)不同田塊連續(xù)2年種植4種轉(zhuǎn)抗除草劑基因的油菜和4種常規(guī)油菜品種對(duì)根際微生物多樣性的影響，通過分析表明，轉(zhuǎn)基因油菜品種的根內(nèi)和根際細(xì)菌群落與常規(guī)品種有差異[25]。Heuer等研究了轉(zhuǎn)T4溶菌酶馬鈴薯，指出T4溶菌酶表達(dá)的馬鈴薯與對(duì)照相比沒有發(fā)現(xiàn)根際群落有偏差[26]。劉明等在溫室試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CryIAb基因玉米（NK4640Bt）和非轉(zhuǎn)基因玉米根際土壤中或添加玉米組織的土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量沒有顯著差異[27-28]。此后，研究者通過SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、CLPP（微生物群落生理代謝指紋）、PLFA（磷脂脂肪酸圖譜）技術(shù)均證實(shí)，轉(zhuǎn)Cry1Ab基因玉米系并未引起土壤微生物群落多樣性的顯著變化。Lin等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗黃瓜花葉病毒的番茄和野生型番茄對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響沒有顯著差異，而且取樣位置比轉(zhuǎn)基因番茄的影響更大[29]。還有研究者發(fā)現(xiàn)，影響因素可能是季節(jié)、天氣、土壤類型、地理位置等環(huán)境因子[30]。環(huán)境因子也是根際微生物群落變化的重要驅(qū)動(dòng)力。本研究發(fā)現(xiàn)，外源基因的轉(zhuǎn)入不會(huì)影響水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性及群落組成與結(jié)構(gòu)。同時(shí)Cd脅迫能顯著影響轉(zhuǎn)基因水稻的基因豐度、多樣性及群落組成與結(jié)構(gòu)。同時(shí)，根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量顯著影響了轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)植物根際土壤微生物的變化是復(fù)雜且長(zhǎng)期的過程，因此評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物的影響時(shí)，應(yīng)該同時(shí)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因作物、親本非轉(zhuǎn)基因作物的長(zhǎng)期效應(yīng)[31]。

綜上所述，本研究采用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻和親本水稻農(nóng)藝性狀及根部Cd吸收富集有顯著影響，Cd60.0與Cd240.0脅迫能顯著降低轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤群落豐度和多樣性，同時(shí)對(duì)土壤細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，該結(jié)果可為轉(zhuǎn)基因水稻環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Borah P，Singh P，Rangan L，et al. Mobility，bioavailability and ecological risk assessment of cadmium and chromium in soils contaminated by paper mill wastes[J]. Groundwater for Sustainable Development，2018，6：189-199.

[2]吳玉峰. 廣西典型高背景鎘地區(qū)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[D]. 南寧：廣西師范學(xué)院，2016.

[3]Applications A B. Global status of commercialized biotech/GM crops[EB/OL]. [2018-01-10]. http：//www.isaaa.org/kc，2004.

[4]劉志誠(chéng)，葉恭銀，胡 萃. 抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻和化學(xué)殺蟲劑對(duì)稻田節(jié)肢動(dòng)物群落的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（12）：2309-2314.

[5]Hu T Z，Zhu S S，Tan L L，et al. Overexpression of OsLEA4 enhances drought，high salt and heavy metal stress tolerance in transgenic rice （Oryza sativa L.）[J]. Environmental and Experimental Botany，2016，123：68-77.

[6]Zhao F Y，Wen L，Zhang S Y. Different responses of plant growth and antioxidant system to the combination of cadmium and heat stress in transgenic and non-transgenic rice[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2009，51（10）：942-950.

[7]Li C H，Zhu J G，Zeng Q，et al. Different responses of transgenic Bt rice and conventional rice to elevated ozone concentration[J]. Environmental Science and Pollution Research，2017，24（9）：8352-8362.

[8]Liang Y，Liu F，Li J，et al. Coexistence of Bacillus thuringiensis （Bt）-transgenic and conventional rice affects insect abundance and plant fitness in fields[J]. Pest Management Science，2018，74（7）：1646-1653.

[9]陳欣瑤，楊惠子，陳楸健，等. 重金屬脅迫下不同區(qū)域土壤的生態(tài)功能穩(wěn)定性與其微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性[J]. 環(huán)境化學(xué)，2017，36（2）：356-364.

[10]Liu B，Zeng Q，Yan F M，et al. Effects of transgenic plants on soil microorganisms[J]. Plant and Soil，2005，271（1/2）：1-13.

[11]Liu W，Lu H H，Wu W X，et al. Transgenic Bt rice does not affect enzyme activities and microbial composition in the rhizosphere during crop development[J]. Soil Biology and Biochemistry，2008，40（2）：475-486.

[12]陳 敏，應(yīng)文荷. 轉(zhuǎn)Bt水稻與常規(guī)水稻根際土壤細(xì)菌類群的比較研究[J]. 杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，4（4）：290-292.

[13]Wang Z J，Deng H，Chen L H，et al. In situ measurements of dissolved oxygen，pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes[J]. Bioresource Technology，2013，132：387-390.

[14]陳 希. 茶園根際土壤與植物體養(yǎng)分對(duì)酸沉降的響應(yīng)[D]. 南昌：南昌大學(xué)，2015.

[15]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：232-248.

[16]薛銀剛，江曉棟，孫 萌，等. 基于高通量測(cè)序的冬季太湖竺山灣浮游細(xì)菌和沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2017，33（11）：992-1000.

[17]許艷蕊，方志軍，盧曉平，等. 基于高通量測(cè)序技術(shù)分析使它隆對(duì)玉米土壤細(xì)菌多樣性的影響[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2017，57（7）：985-993.

[18]余飛宇. 水稻幼苗對(duì)鎘脅迫的反應(yīng)及其與全生育期鎘積累特性的關(guān)系[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2008.

[19]王錦文，邊才苗，陳 珍. 鉛、鎘脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（4）：77-79.

[20]龍思斯，宋正國(guó)，雷 鳴，等. 不同外源鎘對(duì)水稻生長(zhǎng)和富集鎘的影響研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（3）：419-424.

[21]宋 建，金鳳媚，薛 俊，等. 鎘脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)及生理生態(tài)效應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（12）：19-22.

[22]劉小文，齊成媚，歐陽燦斌，等. Pb、Cd及其復(fù)合污染對(duì)紫莖澤蘭生長(zhǎng)及吸收富集特征的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，23（5）：876-883.

[23]朱艷霞，魏幼璋，葉正錢，等. 有機(jī)酸在超積累植物重金屬解毒機(jī)制中的作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（7）：121-126.

[24]王秀麗，徐建民，姚槐應(yīng)，等. 重金屬銅、鋅、鎘、鉛復(fù)合污染對(duì)土壤環(huán)境微生物群落的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（1）：22-27.

[25]Dunfield K E，Germida J J. Diversity of bacterial communities in the rhizosphere and root interior of field-grown genetically modified Brassica napus[J]. FEMS Microbiology Ecology，2001，38（1）：1-9.

[26]Heuer H，Kroppenstedt R M，Lottmann J，et al. Effects of T4 lysozyme release from transgenic potato roots on bacterial rhizosphere relative to communities are negligible natural factors[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（3）：1325-1335.

[27]劉 明，聶 菁，劉紫君，等. 轉(zhuǎn)基因抗病玉米對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：353-356.

[28]Griffiths B S，Caul S，Thompson J，et al. Soil microbial and faunal community responses to Bt maize and insecticide in two soils[J]. Journal of Environmental Quality，2006，35（3）：734-741.

[29]Lin C H，Pan T M. PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis to assess the effects of a genetically modified cucumber mosaic virus-resistant tomato plant on soil microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（10）：3370-3373.

[30]Marschner P，Crowley D，Yang C H. Development of specific rhizosphere bacterial communities in relation to plant species，nutrition and soil type[J]. Plant and Soil，2004，261（1/2）：199-208.

[31]李孝剛，劉 標(biāo)，徐文華，等. 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對(duì)土壤微生物群落生物多樣性的影響[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，27（1）：17-22.